시험 단백질 - 단백질 상호 작용이 단백질 기능의 해부를 위해 불가결이다. 여기서는 소개 체외에서 단백질 단백질 결합 분석. 이 분석은 불용성 단백질 및 솔루션에서 단백질 간의 상호 작용을 테스트하는 신뢰성있는 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
서로 다른 단백질 간의 상호 작용 확인은 분자 수준에서 자신의 생물 학적 기능을 조사 중요합니다. 이 단백질 바인딩을 평가하는 시험 관내 및 생체내 모두에서 여러 가지 방법,, 그리고 서로의 단점을 보완 적어도 두 가지 방법이 신뢰할 수있는 통찰력을 얻기 위해 실시한다.
생체내 분석에 bimolecular 형광 complementation (BiFC) 분석은 살아있는 세포 내에서 단백질 단백질 상호 작용을 감지 수 가장 인기있는 최소 침습적인 접근 방식을 나타냅니다뿐만 아니라 상호 작용하는 단백질의 1,2의 세포 지방화를 확인하십시오. 이 분석에서는, GFP 또는 그 변종의 비 형광 N - 및 C - 터미널 반쪽이 두 융합 단백질 인해 테스트 단백질 '상호 작용을 함께 가지고있을 때 테스트 단백질에 융합, 그리고, 형광 신호가 3-6 재구성합니다 . 그 신호가 epifluorescence이나 공촛점 현미경으로 쉽게 감지할 수 있기 때문에 BiFC은 살아있는 세포 3 단백질 단백질 상호 작용에 대한 연구를위한 세포 생물학 중에서 선택의 강력한 도구로 떠오르고있다. 이 분석은 그러나, 때로는 잘못된 긍정적인 결과를 생성할 수 있습니다. 예를 들어, 형광 신호가 오히려 그 때문에 특정 상호 작용 7, 작은 subcellular 구획의 포장 종료로 인해 서로 멀리로 7 나노미터을 배열이 GFP 조각에 의해 재구성 수 있습니다.
이러한 제한으로 인해, 라이브 셀 이미징 기술에서 얻은 결과는 단백질 상호 작용을 검출 다른 원칙에 따라 독립적인 방법으로 확인하여야한다. 공동 immunoprecipitation (CO - IP) 또는 글루타티온 transferase가 (GST) 풀다운 assays은 일반적으로 체외에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되는 같은 대체 방법을 나타냅니다. 그러나 이러한 assays iIn 그러나, 테스트 단백질의 바인딩에 대한 반응 supportsused 버퍼에 쉽게 용해되어야합니다. 따라서 불용성 단백질을 포함한 구체적인 상호 작용은 이러한 방법에 의해 평가하실 수 없습니다.
여기, 우리는이 어려움을 circumvents 단백질 막 오버레이 바인딩 분석에 대한 프로토콜을 설명합니다. 단백질 중 하나가 막 매트릭스에 고정되기 때문에이 기법에서는, 가용성 및 불용성 단백질 간의 상호 작용을 안정적으로 테스트할 수 있습니다. 이 방법은 같은 BiFC 같은 생체내 실험에서와 함께, 용해와 불용성 단백질 간의 상호 작용을 충실하게 조사하고 특징에 대한 안정적인 접근을 제공합니다. 이 문서에서는 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 사이 바이러스성 휴대 전화 전송 8-14 중 여러 기능을 미치는 운동 단백질 (MP), 그리고 최근에 확인된 식물 세포 interactor, 담배 ankyrin 반복 함유 단백질을 바인딩 (ANK ) 15,이 기술을 사용하여 증명합니다.
프로토콜
1. 표현과 단백질의 추출
- Differentially 자신의 검출을위한 테스트하는 단백질에 태그를 추가하십시오. 더 큰 크기 (예를 들어, GST)의 태그와 멤브레인 (ProIM)에 고정되어야하고, unfused 태그가 고정화 대조군 (ProIMnc)로 사용할 수있는 단백질을 분류. 하나 크거나 작은 태그와 가용성 프로브 (ProSOL)로 사용되는 단백질을 분류. 적절한 대조군 수용성 단백질 (ProSOLnc)에 동일한 태그를 융합하고 감지 바인딩의 특이성을 확인하기 위해 상호 작용 분석에 포함됩니다.
- 태그 단백질을 표현할 수있는 단백질 표정 시스템, 즉, E.을 선택 대장균, baculovirus 등 단백질의 잠재적인 포스트 translational 수정 및 수율에 대한 요구 사항에 따라 다릅니다.
- proteinase 억제제 칵테일을 포함한 SDS - PAGE 로딩 버퍼 (20 % 글리세롤, 4% SDS, 20 MM 트리스 - HCL, pH6.8)을 사용하여 선택의 유기체 (단계 1.2)에서 ProIM 및 ProIM NC의 압축을 풉니다. 15 분 상온에서 세포 현탁액을 남겨, 2 - 메르 캅 토 에탄올 5 분 끓여의 0.5 %를 추가합니다.
- 표준 프로토콜
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토론
이러한 접근 방식은 적어도 단백질의 바인딩을 버퍼에 쉽게 용해되는 중 하나가 성공적으로 단백질 17,18의 다른 조합에 적용했던 단백질의 조합 간의 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트에 적합합니다. 이러한 조건 하에서 모두 불용성의 단백질 사이의 iInteractions이 프로토콜 테스트하실 수 없습니다.
또한, ProIM의 성공적인 refolding은 분석을 위해 중요합니다. 잔여 SDS가 변성 / renaturation 과정에 악영향을 수 있기 때문에 electrotransfer 후 TBS에서 막을 Rinsing 것은 핵심 단계입니다.
마지막으로, 비 특정 바인딩을 피하기 위해, 바인딩 버퍼에 ProSOL의 농도가 1 μg / ML을 초과해서는 안됩니다. 너무 집중되어 있습니다 ProSOL는 ProIM가 아닌 특정 바인딩을 발생할 수 있습니다. 또한, 단계 4.2 동안 사용 하이브 리다이 제이.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저희 연구실의 작품은 VC에 NIH, 식품 및 농업의 국립 연구소 USDA, NSF, 바드,도 및 BSF로부터 기금을 지원합니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 단백질 분석 키트 | 바이오 래드 | 500-0001 | |
| Proteinase 억제제 칵테일 | 시그마 | S8820 | |
| 미니 프로 테우스 시스템 | 바이오 RAD | 165-8000 | |
| 세미 드라이 서부 모래 바닥 SD electrotransfer 시스템 | 바이오 RAD | 170-3940 | |
| 기다려봐 퍼옥시데이즈와 복합 안티 - 토끼 IgG 항체 | GenScript | A00098 | |
| 안티 GST 토끼 polyclonal 항체 | GenScript | A00097 | |
| 안티 strepII | GenScript | A00626 | |
| BioTrace, NT의 nitrocellulose 전송 막 | 팔 과학 | 27377-000 | |
| Immobilon 서부 chemiluminescent HRP 기판 | Millipore | WBKL S0 050 |
참고문헌
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Citovsky, V.
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재인쇄 및 허가
