피하 디하이드로테스토스테론(DHT) 치료: 다낭성 난소 증후군(PCOS)의 마우스 모델

초록

출처: Xue, P., et al. 다낭성 난소 증후군을 연구하기 위한 고안드로겐 마우스 모델. J. Vis. 특급 (2018).

이 기사에서는 마우스에서 다낭성 난소 증후군(PCOS)을 모델링하기 위해 디하이드로테스토스테론(DHT) 펠릿을 준비하고 삽입하는 방법을 설명합니다. 예제 프로토콜은 생식 및 대사 연구에 사용되는 마우스의 절차를 보여줍니다.   

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. PCOS와 유사한 마우스 모델 생성

참고: 이 연구에 사용된 마우스는 배경(C57/B6, CD1, 129Sv)이 혼합되어 있었고 24°C에서 14/10시간 명/암 주기로 음식과 물로 자유롭게 유지되었습니다.

1. DHT 펠릿 준비
   1. 살균을 위한 오토클레이브 실라스틱 튜브. 면도날로 실라스틱 튜브를 15mm 길이로 자릅니다.
   2. 3mL 주사기에 20G의 뭉툭한 바늘을 부착하여 의료용 접착 실리콘을 튜브에 주입하여 한쪽 면을 밀봉합니다. 플런저를 주사기에서 빼낸 다음 접착제를 저장소에 삽입해야 합니다. 플런저를 다시 삽입하고 바늘에서 나오기 시작할 때까지 접착제를 아래로 누릅니다. 무딘 바늘은 20G 바늘의 날카로운 끝 부분을 강한 가위로 잘라서 만듭니다. 튜브의 실리콘 길이는 후반 작업 트리밍이 가능하도록 2mm 이상이어야 합니다.
   3. 밤새 말리십시오. 밀봉된 면에 기포가 있는지 확인하십시오. 기포가 없는 것은 DHT 펠릿에 사용됩니다. 다른 것들은 DHT 제어 펠릿이 없는 데 사용할 수 있습니다.
   4. DHT가 피부에 노출되는 것을 방지하기 위해 후드에서 DHT 펠릿을 만들기 전에 장갑, 마스크, 고글 및 실험복을 착용하십시오.
   5. DHT 분말을 플라스틱 계량 보트에 붓고 접착 뚜껑이 있는 튜브(1.1.1에서 생산)의 열린 면을 DHT 분말에 누릅니다.
   6. DHT 분말은 곧게 펴진 큰 종이 클립으로 밟을 수 있습니다. DHT가 4mm(또는 원하는 길이)의 높이에 도달할 때까지 계속합니다. 자로 DHT의 길이를 확인하고 열린 면을 실리콘으로 밀봉하고 밤새 건조시킵니다.
   7. 밀봉된 각 면을 잘라 실리콘의 길이를 2mm 길이로 만듭니다. 펠릿의 총 길이는 8mm입니다.
   8. 빈 실라스틱 튜브의 양면을 대조군(no-DHT) 펠릿으로 밀봉합니다.
   9. 펠릿을 호일로 싸서 (빛 노출을 방지하기 위해) 사용할 때까지 실온에서 50mL 원추형 튜브에 보관하십시오. DHT 펠릿은 최소 3개월 동안 완전한 효능을 유지합니다.
2. DHT 삽입 및 교체
   1. 최대 20개의 DHT 펠릿 또는 대조군 펠릿을 30mL 멸균 0.9% 식염수가 포함된 50mL 원뿔형 튜브에 37°C에서 24시간 동안 삽입하여 삽입 직전 평형을 이
   룹니다.
   2. 수술 전에 표면과 장갑은 클리독스로 소독하고 작업 표면은 깨끗한 플라스틱 뒷면 흡수지(수술 패드)로 덮습니다. 동물과 접촉하는 모든 기구는 고압멸균으로 동물 시설에 들어가기 전에 오염을 제거합니다. 기구는 사용 전에 건조 및 냉각됩니다.
   3. 2개월 된 암컷 마우스(4-5 마우스/케이지)를 사용합니다. 마우스는 인슐린 주사기를 사용하여 자일라진(3.5mg/kg bw) 및 케타민(78.8mg/kg bw)을 복강내 주사합니다. 마취의 혼합 및 투여에 대한 계산은 표 1에 나와 있습니다.
   4. 적절한 마취가 이루어진 후 발가락 반사 상실 및 느린 호흡으로 측정된 바와 같이 마우스는 수술을 준비합니다.
   5. 멸균 거즈를 사용하여 베타딘으로 해당 부위의 피부를 소독하고 70% 에탄올로 청소합니다.해당 부위는 다시 베타딘으로 칠해집니다.
   6. 목 근처의 피부 아래에 가위로 약 5mm 길이의 구멍을 자릅니다. 10G 트로카를 사용하여 로스트 방향으로 작은 터널(15mm)을 만듭니다. 펠릿은 트로챠와 함께 등쪽으로 삽입됩니다.
   7. 그런 다음 개구부를 수술용 접착제로 밀봉합니다. 집게와 부드러운 칫솔질로 상처 가장자리를 수동으로 근사화하여 근사화된 상처 가장자리에 액체 접착제의 얇은 필름을 적용합니다. 접착제가 상처 부위에 고르게 분포되도록 3겹의 얇은 접착제를 쌓습니다. 접착제는 부착된 상처 가장자리의 각 측면에서 1cm씩 확장되어야 합니다. 봉합사 또는 수술 클립을 사용하여 구멍을 막을 수도 있습니다. 회수를 위해 열 패드가 있는 개별 수용 중인 쥐를 케이지에 다시 넣습니다. 안드로겐 노출을 일정한 수준으로 유지하기 위해 4주마다 펠릿을 교체하십시오. 원래 펠릿이 제거되고 새 펠릿이 위에서 설명한 대로 유사한 위치에 삽입됩니다.

케타민 (100mg/mL)	자일라진 (100mg/mL)	생리 (0.9%)
175 마이크로L	15 마이크로L	810 마이크로L
작업 용액의 복강 내 주사 : 0.1 mL / 20g 체중

표 1. 케타민/자일라진 칵테일.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
결정질 5α-DHT 분말	시그마-알드리치	A8380-1G
Dow 코닝 실라스틱 튜빙	피셔 사이언티픽	11-189-15D	0.04in/1mm 내경 x 0.085in/2.15mm 외경
의료용 접착 실리콘	요인 II, InC.	A-100
고글, 실험실 가운, 장갑 및 마스크
3 mL 주사기	Becton, Dickinson and Company (BD)
부속 바늘 : 20G	BD	305176
자: 밀리미터 눈금이 있는 10cm 이상의 길이.
자일라진	Vet one AnnSeA LA, MWI, 보이시	100 마그네슘 / mL
케타민 염산염	호스피라, Inc	NDC 0409-2051-05	100 마그네슘 / mL
수술용 스테이플	AutoClip® 시스템, 정밀 과학 도구
인슐린 주사기	BD	329461	1/2 CC, 저용량 U-100 인슐린 주사기
투관침	Innovative Research of America (미국 혁신 연구)	MP-182
면도날	피셔 사이언티픽	12-640
클리독스	피셔 사이언티픽	NC0089321
수술용 언더패드	피셔 사이언티픽	50587953	앤드윈 사이언티픽 56616018
Betadine 방부제 솔루션	월그린스
3M Vetbond (n-부틸 시아노아크릴레이트)	3M 과학. 생활에 적용

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