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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 마우스의 기본 하우징
- 바닥과 측면이 단단한 플라스틱 케이지에 쥐를 수용하고 부드러운 침구 층과 종이 파쇄와 같은 중첩 재료 층을 만듭니다. 잘게 썬 옥수수 속대나 나무 부스러기로 구성된 침구를 사용하고 위생을 위해 침구를 정기적으로 교체하십시오.
- 식량과 물에 대한 접근을 자유자재로 제공합니다. 플라스틱 케이지의 상단에는 식품 호퍼가 있습니다. 식품 호퍼에서 적절하게 배합된 마우스 식품 펠릿을 분배하고 물 디스펜서를 제공합니다. 케이지 상단에 외부 오염 물질로부터 마우스를 보호하기 위한 공기 필터가 있는지 확인하십시오.
- 사육 시설에서 12시간 동안 명암 주기를 따라 생쥐의 자연스러운 일주기 리듬을 유지합니다. 하루 중 같은 시간에, 이상적으로는 저녁 시간과 같이 동물의 어두운 주기 동안 행동 테스트를 수행하는 것이 좋습니다.
메모: 하우징에서 마우스를 구별하기 위해주의를 기울여야합니다. 귀 펀치, 귀 태그 및 꼬리 표시와 같은 마우스를 구별하는 다양한 방법을 사용할 수 있습니다.
2. Barnes Maze Testing: 건설
- 지름 120cm의 원형 나무 판자를 구합니다.
- 원 둘레에 20개의 원형 구멍(직경 4.5cm)을 자릅니다. 각 구멍을 미로 가장자리에서 2.5cm, 인접한 구멍에서 13cm 떨어진 곳에 배치합니다.
- 표면을 매끄럽게 하고 광택이 나는 흰색으로 칠합니다(밝은 색상 권장).
- 20개의 구멍 각각에서 약 2-3cm 떨어진 곳에 작은 컵 고리를 삽입하기 위해 미로 보드의 한쪽을 지정하고 각 구멍에 두 개의 고리를 놓습니다(각 구멍의 양쪽에 하나씩).
- 얕은 검은색(플라스틱) 디스크를 사용하여 미로 측면의 구멍을 고리로 덮습니다. 디스크를 미로 바닥에 고정하기 위해 고리를 사용하여 두꺼운 고무 밴드를 고정합니다.
- Barnes 미로를 지면에서 120cm 높이에 안전하게 설치하고 테이블이나 의자와 같이 비슷한 높이의 다른 물체에서 멀리 떨어뜨립니다. 상자나 의자를 사용하여 미로 중앙을 지탱할 수 있습니다.
- 각 벽(삼각형, 원, 십자형)에 한 가지 모양의 큰 흰색 포스터를 미로의 3면에 추가 미로 신호로 배치합니다. 각 시도에 대해 미로 주변 벽에 붙은 포스터를 유지하십시오.
- 미로의 마지막 면에는 관찰자를 숨길 수 있는 단단한 검은색 커튼을 설치하여 연구원이 미로에 있는 쥐에게 보이지 않고 데이터를 정확하게 기록할 수 있습니다.
- 경기장 위에 비디오 카메라를 매달아 전체 미로 표면을 조감도로 볼 수 있습니다.
- 미로의 모든 표면(검은색 디스크 및 대상 상자 포함)을 물로 세척한 다음 각 마우스 시험 전후에 70% 에탄올 용액을 사용합니다.
- 100W 광원을 미로 중심에서 25cm 위에 놓고 (시험 시작 / 종료시 켜기 / 끄기) 디스크와 고리가 바닥을 향하도록하십시오 .
메모: 테스트 중에는 실내의 다른 모든 오버헤드 조명을 꺼야 합니다. 100W 조명 옆에 매달린 초음파 노이즈 메이커를 추가하는 것이 좋습니다. 각 평가판의 시작/종료 시 켜거나 끕니다.
3. Barnes Maze 테스트 : 절차
참고: 각 시험 전후에 모든 미로 구성 요소를 물과 70% 에탄올 용액으로 세척하여 테스트를 재개하기 전에 완전히 건조될 시간을 확보하십시오. 시험 준비를 위한 청소 용품과 타이머를 준비하십시오.
- 신뢰할 수 있는 식별 방법을 사용하는 동안 모든 마우스를 그룹으로 수용합니다. 쥐가 미로에서 활발하게 뛰지 않을 때 시험장 밖에 두십시오. 이는 초음파 노이즈 메이커에 조기에 노출되지 않도록 하기 위한 것입니다.
- 발을 손에 쥔 상태에서 꼬리 밑에서 쥐를 부드럽게 집어 들고 쥐를 다루십시오.
- 훈련을 위해 마우스가 7일 연속으로 하루에 한 번 미로를 달리게 하여 학습/습득을 평가합니다.
메모: 기억/기억력을 평가하기 위해 나중에 한 번의 장기 시험을 수행할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 산후 32일째부터 청소년기 마우스를 훈련시켰으며, 생후 4개월이 된 성인을 대상으로 장기 시험을 수행했습니다.
- 테스트 기간 동안 사용할 대상 구멍에 각 마우스를 무작위로 할당합니다. 구멍은 미로의 바닥 또는 미로 둘레 바깥쪽에 1-20으로 표시할 수 있으며, 미로에서 마우스는 볼 수 없습니다.
- 할당된 구멍 디스크를 작은 검은색 상자(23 x 11cm)로 교체합니다. 가장 가까운 고리에 연결된 고무 밴드를 사용하여 Barnes 미로에 단단히 부착하십시오.
메모: 대상 상자는 마우스가 쉽게 아래로 내려갈 수 있을 만큼 충분히 얕거나 마우스가 아래로 점프할 필요가 없도록 하는 단계를 포함합니다.
- 실험이 시작될 때까지 30초 동안 적응할 수 있도록 컵 아래 미로 중앙에 마우스를 놓습니다. 비디오 녹화를 시작합니다.
- 조명과 초음파 노이즈 메이커를 켭니다. 동물의 초기 방향이 편향되지 않도록 끈 메커니즘을 통해 컵을 들어 올립니다. 타이머를 시작하고 커튼 뒤에 앉아 관찰하십시오.
- 마우스가 대상 구멍에 들어간 후 시험 시작 시 사용한 것과 동일한 불투명 컵이나 바인더로 구멍을 덮고 초음파 노이즈 메이커를 끕니다. 5분이 경과한 후에도 마우스가 목표물에 들어가지 않으면 마우스를 목표 구멍에 집어넣습니다.
- 마우스가 구멍에 들어가는지 확인합니다. 마우스가 타겟 상자 안에 있으면 구멍을 막고 노이즈 메이커를 끕니다. 마우스를 방해받지 않고 1분 동안 대상 상자에 그대로 두십시오.
- 목표 구멍은 훈련 기간 동안 각 마우스에 대해 일정하게 유지되지만 매일 임의의 순서로 마우스를 실행하여 이전 마우스가 남긴 신호/냄새를 따르지 않도록 합니다.