전신 필로카르핀 치료: 측두엽 간질의 마우스 모델

초록

출처: Kim, J. E. and Cho, K. O. 생쥐의 방사선 텔레메트리 시스템을 사용한 측두엽 간질 및 EEG 모니터링의 필로카핀 모델. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 측두엽 간질을 모델링하기 위해 필로카르핀의 전신 투여를 통해 마우스에서 간질(SE) 상태를 유도하는 절차를 제시합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. SE 유도

1. 8주 된 수컷 C57BL/6NHsd 마우스를 구입하고 각 마우스의 무게를 측정합니다. 그런 다음 SE 유도 중에 쉽게 식별할 수 있도록 마커 펜을 사용하여 모든 마우스의 꼬리를 표시합니다.
2. 마우스 체중을 기준으로 스코폴라민 메틸 브로마이드(스코폴라민, 2 mg/kg), 테르부탈린 헤미설페이트(테르부탈린, 2 mg/kg) 및 필로카르핀 염산염(필로카르핀, 280 mg/kg)의 양을 계산하고 식염수(0.9% NaCl, 10 mL/kg)를 추가하여 용액을 만듭니다.
   참고: 예를 들어, 마우스의 무게가 25g인 경우 스코폴라민 및 테르부탈린: 2mg/kg * (25g/1,000g) = 0.05mg, 식염수: 10mL/kg * (25g/1,000g) = 0.25mL, 필로카르핀: 280mg/kg * (25g/1,000g) = 7mg, 식염수: 10mL/kg * (25g/1,000g) = 0.25mL.
3. 스코폴라민과 테르부탈린 혼합물을 1mL 주사기에 30G 바늘과 함께 로드합니다. 용액을 각 마우스에 복강내로 주입한 다음 마우스를 케이지로 되돌립니다. 스코폴라민과 테르부탈린 투여 후 30분에 필로카르핀 용액을 각 마우스에 주입합니다(i.p., 1mL 주사기, 30G 바늘). 필로카르핀 주사 직후, 관찰을 위해 쥐를 인큐베이터(28–30°C)에 넣습니다.
4. SE가 유도될 때까지 마우스의 거동을 주의 깊게 모니터링하십시오. 라신 척도에 따라 3단계 이상에 해당하는 변연계 운동 발작이 감지되면 시간을 기록하고 쥐를 모니터링하여 발작이 더 자주 발생하는지 확인합니다. 지속적인 운동 발작이 2분 이상 지속되면 마우스를 실온의 새 케이지에 넣고 3시간 동안 계속 모니터링하여 경련 발작이 계속되고 SE가 유발되는지 확인합니다. 필로카르핀 주사 후 약 2시간 후에 SE에 진입하지 못한 마우스를 안락사시킵니다.
   참고: 라신의 비늘; 1단계, 입과 얼굴의 움직임; 2단계, 고개 끄덕임; 3단계, 앞다리 간대성; 4단계, 앞다리 클론으로 사육; 5단계, 앞다리 클론누스로 양육 및 낙하. SE 유도 직후 마우스를 실온의 케이지로 옮기지 않으면 마우스가 고열로 인해 죽을 수 있습니다.
5. SE 발병 후 3시간 후에 디아제팜 용액(i.p., 10mg/kg, 1mL 주사기, 30G 바늘)을 주입하여 행동성 급성 발작을 종결시킵니다. 식염수(ip, 10mL/kg, 1mL 주사기, 30G 바늘)를 첨가하여 10% 폴리옥실 35 경화 피마자유에 5mg/mL의 디아제팜을 희석하여 디아제팜 용액을 만듭니다.
   참고 : 10 % 폴리 옥실 35 수소화 피마자 기름 용액 : 1mL 폴리 옥실 35 경화 피마자유 용액 + 9mL 식염수. 용액을 실온에 보관하십시오. 예를 들어, 마우스 체중이 25g인 경우 250μL의 디아제팜 용액을 주입합니다: 50μL 5mg/mL 디아제팜 + 200μL 10% 폴리옥실 35 경화 피마자유 용액 = 250μL 1mg/mL 디아제팜.
6. 가짜 마우스의 경우, 스코폴라민 메틸 브로마이드와 테르부탈린 헤미설페이트 혼합물(i.p.; 둘 다 2mg/kg, 10mL/kg; 1mL 주사기; 30G 바늘)의 i.p. 주사를 수행합니다.30분 후, 식염수를 복강내로 주사합니다(i.p.; 10mL/kg; 1mL 주사기; 30G 바늘).
   참고: 마우스 체중이 25g인 경우 필로카르핀 대신 식염수 250μL를 주입합니다.
7. 디아제팜 주사(i.p.; 1mL 주사기; 30G 바늘) 후 개별 마우스 1개당 5% 포도당 1mL(i.p.; 1mL 주사기, 26G 바늘)를 투여합니다.
   참고: 1mL의 5% 포도당 주사는 생존율을 높일 수 있는 에너지원과 수분을 제공합니다.
8. 인큐베이터(28-30°C)에서 사후 관리 중에는 침, 눈물, 대변 등 과도한 분비물을 닦아냅니다.
9. SE 유도 후 1일차에 마우스의 무게를 측정하고 인큐베이터(28–30 °C)에 하루 더 보관합니다. SE 유도 후 2일차에 생쥐의 무게를 측정하고 집 케이지로 되돌립니다. 회복을 촉진하기 위해 촉촉한 차우를 제공하십시오.
   참고: 이 실험에서 SE 종결 후 C57BL/6NHsd의 폐사율은 평균 8.57%였습니다(테스트된 35마리의 마우스 중 3마리).
10. 필로카르핀 투여 후 7일까지 동물의 일일 체중을 측정하고 체중이 증가하지 않을 때 마우스에 5% 포도당(i.p., 1mL 주사기, 26G 바늘)을 주입합니다. 생쥐가 체중을 회복하기 시작하면 체중 모니터링을 중지하고 필로카르핀 주사 후 2일 후에 어려움 없이 촉촉한 차우를 섭취합니다.
    참고: SE 후 7일까지 마우스의 체중이 증가하지 않으면 실험에서 마우스를 제외시키고 이산화탄소로 안락사시킵니다. 마우스의 배경에 따라 때때로 죽음이 발생할 수 있습니다. 그러나 C57BL/6NHsd의 경우 이러한 실험에서 1% 미만의 마우스가 사망했습니다. SE 유도 후 7일 이상 생존하면 잠복기 동안 마우스가 거의 죽지 않습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6	엔비고	C57BL/6NHsd
스코폴라민 메틸 질산염	시그마	S2250	10X 재고 만들기
테르부탈린 헤미설페이트 염	시그마	T2528	10X 재고 만들기
필로카르핀 염산염	시그마	P6503
디아제팜	삼진(京金��
피마자유(Kolliphor EL)	시그마	C5135	Polyoxyl 35 수소화 피마자기름
식염수	(주)대한제약(주)
5% 포도당	(주)대한제약(주)
1 mL 주사기	Sung shim medial Co., Ltd. (성심메디알 주식회사)
26 게이지 바늘	Sung shim medial Co., Ltd. (성심메디알 주식회사)		26G * 13mm(1/2인치)
30 게이지 바늘	Sung shim medial Co., Ltd. (성심메디알 주식회사)		30G * 13mm(1/2인치)

(영어)