종양에서 오가노이드 준비: 3D 체외 종양 모델

여기에 설명된 동물 절차는 뉴욕 버팔로에 있는 로스웰 파크 종합 암 센터의 실험실 동물 자원부의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다.

참고: 오가노이드 생성을 위해 전립선 또는 전립선 종양을 분리하기 위해 해부할 수컷 마우스는 최소한 성적 성숙 연령(약 8-10주)에 도달해야 합니다. 마우스의 구체적인 연령은 연구마다 다를 수 있습니다. 연령을 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 요인에는 전립선 세포 집단의 연령에 따른 변화, 특정 프로모터 주도 Cre 전이유전자의 연령에 따른 발현, 특정 GEMM의 전립선 종양 진행 속도 등이 있습니다.

참고: 그림 1은 종양 오가노이드 생성 절차에 대한 그림 설명을 보여줍니다.

1. 준비

1. Drost et al.에 따라 다음과 같은 변형으로 마우스 전립선 오가노이드 배지를 준비합니다. Noggin 및 R-Spondin에 대해 재조합 단백질 대신 컨디셔닝 배지를 사용하고 Noggin 및 R-Spondin 컨디셔닝 배지 모두에 대해 10% 대신 1%(v/v)의 최종 농도를 사용합니다.
   참고: HA-마우스 Noggin-Fc 또는 HA-마우스 Rspo1-Fc로 안정적으로 형질 주입된 HEK293 세포는 각각 Noggin- 또는 R-Spondin- 조건의 배지를 생산하는 데 사용됩니다. 이 세포주는 스탠포드 대학의 Calvin Kuo 실험실에서 선물한 것입니다.
2. 20mg/mL 콜라겐분해효소 II를 Advanced DMEM/F12(+++) 배지로 희석하여 최종 농도 5mg/mL로 15mL 튜브에서 분해 용액을 준비합니다. Y-27632 Rock Inhibitor를 10 μM.
   의 최종 농도로 collagenase II 용액에 추가합니다. 참고: 조직에 대한 소화 완충액의 비율은 1 mL - 50 mg이며, Drost et al.에 따르면 이를 사용합니다.

2. 종양 조직의 다지기 및 소화

1. 세포 배양 후드에서 전립선 종양 조직을 멸균 10cm 배양 접시에 넣고 괴사 조직을 해부하여 폐기합니다.
2. 멸균된 곡선 집게로 조직 조각을 잡고 해부 가위로 절단하여 남아 있는 전립선 종양 조직을 1mm³개의 입방체로 다집니다.
3. 다진 종양 조각을 집게의 구부러진 면으로 퍼서 소화 버퍼가 있는 15mL 튜브에 넣습니다. 종양 조직을 37°C에서 1.5-2시간 동안 흔들면서 소화합니다. 20분마다 소화 진행 상황을 확인하십시오.
   참고: 이때 -20°C 보관에서 매트릭스 2mL 이상을 꺼내 얼음 위에서 해동하십시오. 1mL의 매트릭스 분취량은 해동하는 데 약 3시간이 걸립니다.
4. 조직 분해 후 175 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리 튜브를 사용하여 세포 펠릿을 형성합니다.
5. 상층액을 제거하고, 튜브를 튕겨 세포 펠릿을 느슨하게 한 다음, 10μM Y-27632 Rock Inhibitor가 보충된 예열 트립신 1mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 튜브를 37°C 수조에 5분 동안 넣습니다.
6. 배양 후 표준 P1000 팁으로 5회 위아래로 피펫팅합니다. 튜브를 37°C 수조에 다시 5분 동안 넣고 2.6.
   단계를 반복합니다. 참고: 이때 시술에서 멸균 6웰 세포 배양 접시를 55°C 인큐베이터에 넣어 따뜻하게 합니다.

3. Matrix에서 세포 계수 및 재현탁

1. 차가운 AdDMEM/F12(+++) 9mL를 첨가하여 세포를 세척하고 175 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
2. 원심분리 후 상층액을 제거하고 튜브를 튕겨 펠릿을 느슨하게 한 다음 10mL의 차가운 AdDMEM/F12(+++)를 첨가하여 세포를 다시 세척합니다. 175 x g에서 튜브를 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
3. 원심분리 후 상층액을 제거하고 튜브를 튕겨 펠릿을 느슨하게 한 다음 1mL의 AdDMEM/F12(+++)에 세포를 재현탁하고 표준 절차에 따라 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
4. 7-8개의 돔은 오가노이드가 드롭 와이즈 방식으로 매트릭스에 도금될 때 6웰 접시의 한 웰에 맞습니다. 약 200μL의 매트릭스는 7-8개의 돔을 생성합니다. 향후 실험 목적을 위해 얼마나 많은 웰의 오가노이드가 필요한지 결정하고 필요한 매트릭스의 부피를 계산합니다. 그런 다음 매트릭스의 1.0 x 10⁶ cells/mL의 최종 농도를 갖는 데 필요한 세포 함유 용액의 부피를 계산합니다.
5. 세포 계수 후 175 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 제거하고 튜브를 튕겨 펠릿을 느슨하게 한 다음 3.4.
   단계에서 계산된 매트릭스의 부피로 세포를 재현탁합니다. 참고: 매트릭스는 4 ° C에서만 액체 형태로 유지됩니다. Matrix stock tube와 matrix-cell 용액을 항상 얼음 위에 보관하십시오.

4. 도금 매트릭스 돔 및 미디어 적용

1. 매트릭스 셀 용액을 P200 피펫과 혼합하여 기포 없이 셀을 고르게 분포시킵니다. 6 ° C 인큐베이터에서 55-well 배양 접시를 꺼냅니다.
2. 200 μL의 매트릭스 셀 용액을 조심스럽게 피펫팅하고 용액을 웰에 빠르게 떨어뜨려 돔을 만듭니다.
3. 매트릭스 셀 용액의 부피가 소비될 때까지 4.2단계를 반복합니다. 돔이 실온에서 2분 동안 굳어지도록 합니다.
4. 6웰 접시를 거꾸로 뒤집고 접시를 37°C 인큐베이터에 넣어 20분 동안 응고를 계속합니다.
5. 배양 후 각 웰에 2mL의 마우스 전립선 오가노이드 배지를 추가합니다. 1nM의 최종 농도를 위해 각 웰에 합성 안드로겐 R1881을 추가하고 Y-27632 암석 억제제를 10μM의 최종 농도에 추가합니다. 조심스럽게 혼합하고 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣어 배양합니다.
   참고: 오가노이드 배양 배지는 오가노이드 생성 후 1주일 동안만 10μM Y-27632 Rock Inhibitor를 보충하면 됩니다.

그림 1: 전립선 종양 오가노이드 생성을 위한 프로토콜의 흐름도. 전립선 종양을 절개한 후 조직을 1mm 조각으로 다집니다. 콜라겐분해효소에서 종양 조각을 소화하고, 세포를 모으고, 트립신에서 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 세포를 계수한 후 1.0 x 106 cell/mL 세포 농도에 필요한 매트릭스 부피를 재현탁합니다. 드롭 와이즈 방법을 사용하여 접시에 접시 돔을 만듭니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.