난소암의 기능화된 나노입자 표적화: 난소암 세포의 엽산 접합 나노입자 조영제 흡수를 촉진하는 기술

초록

출처: Lusk, J. F. et al. 광음향 유세포 분석을 사용한 난소암 검출. J. Vis. 특급 (2020년)

이 비디오에서는 엽산으로 덮인 황화구리 나노 입자(CuS NP)의 내재화를 촉진하는 기술을 보여줍니다. 엽산 기능성 CuS NP는 많은 난소암 세포에서 과발현되는 엽산 수용체를 표적으로 삼을 수 있는 능력이 있습니다.

프로토콜

1. 나노 입자 합성 및 기능화

주의: 모든 합성은 환기가 되는 화학 흄 후드에서 이루어져야 합니다.

1. 합성하기 전에 0.2μm 멸균 필터를 통해 약 300mL의 탈이온(DI) 물을 여과합니다.
2. 250mL 유리 둥근 바닥 플라스크를 세제 용액으로 세척하고 DI 물로 헹굽니다. 0.0134g의 CuCl₂를 DI 물 100mL에 첨가하여 1mM 용액을 만듭니다.
3. CuCl₂ 용액에 0.015g의 엽산(FA)을 넣고 마그네틱 교반 막대를 사용하여 ~5분 동안 저어줍니다.
4. 200 μL 피펫을 사용하여 반응 혼합물에 약 10 초에 걸쳐 Na₂S·9H₂O (100 μL DI 물에서 0.024 g)를 첨가합니다 .
   메모: Na₂S·9H₂O를 첨가하면 용액의 색이 밝은 노란색에서 짙은 갈색으로 바뀝니다.
5. 반응을 마개하고 90°C로 설정된 오일 배스에 넣고 마그네틱 교반 막대로 계속 저어줍니다. 약 15분 후 또는 오일 배스가 85-90°C에 도달하면 추가로 한 시간 동안 반응을 진행하십시오. 혼합물이 점차 짙은 녹색으로 변해야 합니다.
   메모: 압력 상승을 방지하기 위해 반응 혼합물을 가열하는 동안 시스템을 환기
시키십시오.
6. 오일 수조에서 반응 용기를 제거하고 얼음 수조로 옮기기 전에 약 10-15분 동안 실온에서 잠시 냉각합니다.
7. 반응 혼합물이 20 °C 이하로 냉각되면 1M NaOH를 사용하여 pH를 10으로 조정하여 나머지 엽산을 용액에 용해시킵니다.
8. 30kDa 원심분리 컬럼을 사용하여 FA-CuS 반응 혼합물을 정제합니다. 15mL 배치의 용액을 컬럼에 추가하고 3,082 x g에서 15분 동안 원심분리합니다.
9. 모든 반응 혼합물이 농축되면 농축된 분획을 재결합하고 30kDa 원심분리 컬럼에서 15mL의 pH 10 NaOH로 4x 세척합니다.
10. 질량 측정의 경우 용액의 1/3(~66 μL)을 3개의 유리 바이알로 분할합니다. ~27mmHg의 진공 상태에서 40°C의 진공 오븐에서 밤새 건조합니다.
11. 나머지 2/3의 농축 용액을 250μL의 PBS에 용해시키고 나중에 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
12. FA-CuS NP를 사용하기 전에 높은 설정의 수조 초음파 발생기에서 30 분 동안 초음파 처리하십시오.

2. 난소암 세포에 의한 FA-CuS NP 흡수

1. FA-CuS NP로 배양하기 전에 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 8-15mL의 엽산이 없는 RPMI-1640 배지가 있는 T75 플라스크에서 SKOV-3 세포를 최소 24시간 동안 배양합니다.
2. 0.1 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 엽산이 없는 RPMI-1640 완전 성장 배지 0.5mL의 세포를 24웰 플레이트에 파종합니다.
3. 다음 날, 엽산이 없는 RPMI-1640 완전 성장 배지 0.5mL에 400μg/mL FA-CuS NPS가 포함된 세포를 2시간 동안 배양합니다.
4. 이 배양 후 EDTA와 함께 0.25% 트립신 0.5mL로 세포를 트립신화합니다. 트립신을 중화하기 위해 최소 1mL의 엽산이 없는 RPMI-1640 완전 성장 배지를 추가하고 123 x g에서 6분 동안 세포를 원심분리합니다.
5. 상층액을 제거하고, PBS 2mL에 세포를 재현탁시킨 후, 123 x g에서 6분 동안 원심분리를 수행합니다. 이 세척 단계를 2x 수행하여 결합되지 않은 NP를 제거합니다.
6. 1-2mL의 PBS에 2% Tween 용액으로 세포를 재현탁합니다.
7. 혈구계와 Trypan Blue를 사용하여 세포를 계수합니다. 또한 세포 수가 너무 많으면 세포를 희석하십시오. PBS의 세포를 검출을 위해 선택한 농도로 2% Tween으로 희석합니다.
8. 이제 PAFC 시스템에서 세포를 분석할 준비가 되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.025% 트립신과 EDTA	코 닝	재질 보기 25-053-CL
Amicon Ultra-15 원심 분리 필터	밀리포어	UFC903024
Amicon Ultra-4 원심 분리 필터	밀리포어	UFC803024
Bright-Line 혈구분석기	Hausser 사이언티픽	1492
구리(II) 염화물	아크로스 오가닉스	206532500
CPX 시리즈 디지털 초음파 세척 수조	피셔브랜드	모델 CPX3800
Norm-Ject 10mL 시린지	헨케 사스 울프	4100-X00V0
FBS(증권 시세	시그마-알드리치	F2442-500ML
엽산	시그마-알드리치	F7876-10G
PBS (PBS)	알파 에자르	J62036
페니실린 스트렙토마이신	지브코	15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) 엽산 무함유	지브코	27016-021
SKOV-3 세포	증권 시세	HTB-77
수산화나트륨 비드	증권 시세 표시기	BDH9292-500지
황화나트륨 Nonahydrate	시그마-알드리치	431648-50지
Trypan 블루 솔루션 0.4%	암레스코	K940-100ML
0.2μm 멸균 주사기 필터	폭스바겐	28145-477
알코녹스	시그마-알드리치	242985-1.8KG	유리 제품 청소에 사용되는 세제.
트윈 20	시그마-알드리치	P7949-100ML

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