방법 논문

미토콘드리아 분리: 인간 난소암 조직 샘플에서 미토콘드리아를 분리하는 기술

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Zhan, X. et al. 난소암 조직에서 미토콘드리아의 준비 및 정량적 단백질체학 분석을 위한 난소 조직 제어. J. Vis. 특급 (2019)

이 동영상은 밀도 구배 원심분리와 함께 차등 속도 원심분리를 사용하여 인간 난소암 조직에서 미토콘드리아를 분리하는 절차를 설명합니다. 분리된 미토콘드리아는 인간 난소암 미토콘드리아 단백질체의 단백질체 분석에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

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인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 인간 난소암 조직에서 미토콘드리아의 제조

난소암 조직(n = 7)을 포함한 난소 조직 샘플이 이 프로토콜에 사용되었습니다.

  1. 210mM 만니톨, 70mM 자당, 100mM 염화칼륨(KCl), 50mM 트리스-HCl, 1mM 디아민 테트라아세트산(EDTA), 0.1mM 에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸 에테르)테트라아세트산(EGTA), 1mM 페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF) 프로테아제 억제제, 2mM 오르토바나데이트나트륨(V) 및 0.2% 소 혈청 알부민(BSA)을 혼합하여 미토콘드리아 분리 완충액 250mL를 준비합니다. 산도 7.4.
  2. 깨끗한 유리 접시에 난소암 조직 ~1.5g을 담습니다.
  3. 미리 냉각된 미토콘드리아 분리 완충액 2mL를 추가하여 조직 표면의 혈액을 3번 가볍게 씻어냅니다.
  4. 깨끗한 안과 가위를 사용하여 조직을 약 1mm3조각으로 완전히 다지고 다진 조직을 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
  5. 0.2 mg/mL nagarse를 함유한 미토콘드리아 분리 완충액 13.5mL를 첨가한 다음 전기 균질기를 사용하여 다진 조직(2분, 4°C 간격)을 균질화(scale 2, 10 s 6x, interval 10 s 사용)합니다.
  6. 조직 균질액에 3mL의 미토콘드리아 분리 완충액을 더 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합합니다.
  7. 제조된 조직 균질액(1,300 x g, 10분, 4°C)을 원심분리한다. 조잡한 핵 분획(즉, 펠릿)을 제거하고 상등액을 유지합니다.
  8. 상층액(10,000 x g, 10분, 4°C)을 재원심분리합니다. 마이크로솜(즉, 상등액)을 제거하고 펠릿을 보관하십시오.
  9. 2mL의 미토콘드리아 분리 완충액을 추가하고 광 피펫팅으로 펠릿을 잘 재현탁합니다.
  10. 펠릿 현탁액을 원심분리기합니다(7,000 x g, 10분, 4°C). 상등액을 버리고 미처리 미토콘드리아(즉, 펠릿)를 유지합니다.
  11. 12mL의 25% 밀도 구배 배지(즉, Nycodenz)를 추가하여 추출된 미토콘드리아를 재현탁합니다.
  12. 튜브에 34% 5mL, 30% 8mL, 25% 미토콘드리아 12mL(1.11단계의 미토콘드리아 조잡이 포함), 23% 8mL 및 20% 밀도 구배 배지 3mL를 아래에서 위로 채우고 원심분리(52,000 x g, 90분, 4°C)하여 불연속 밀도 구배를 만듭니다.
  13. 길고 뭉툭한 주사기를 사용하여 25%와 30% 밀도 구배 매체 사이의 계면에서 정제된 미토콘드리아를 깨끗한 튜브로 수집합니다.
  14. 수집된 미토콘드리아에 미토콘드리아 분리 완충액을 추가하여 3배 부피로 희석합니다. 원심분리기(15,000 x g, 20분, 4°C)를 사용하여 상층액을 폐기합니다.
  15. 펠릿과 원심분리기를 재현탁하기 위해 미토콘드리아 분리 완충액 2mL를 추가합니다(15,000 x g, 20분, 4°C). 상등액을 버리고 펠릿을 보관하십시오.
  16. 최종 펠릿(즉, 정제된 미토콘드리아)을 수집하고 -20 °C에서 보관합니다.
    메모: 정량적 단백질체학 분석을 위해 난소암 조직에서 정제된 모든 미토콘드리아를 미토콘드리아 샘플로 결합합니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
디아민 테트라아세트산(EDTA)시그마798681-100지무수, 자유 유동, Redi-Dri, ≥98%
디티(DTT)시그마101977770011,4-디티오트레이토
에틸렌 글리콜 비스(2-아미노에틸 에테르)테트라아세트산(EGTA)시그마E0396-10G바이오엑스트라, ≥97 .0%
균질 화기사일런트셰이크HYQ-3110
저온 초고속 원심분리기에펜도르프5424R
원심 분리기샹이(XiangYiTDZ4--WS
만니톨맥클린M813424-100지만니톨은 과당에서 수소화하여 생산되는 폴리올(다가 알코올)로 감미료, 보습제 및 증량제로 작용합니다. 흡습성이 낮고 오일 지급 능력이 좋지 않습니다.
페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF) 프로테아제 억제제솔라바이오P0100-1MLPMSF는 세린 잔기와 반응하여 트립신, 키모트립신, 트롬빈, 파파인을 억제하는 프로테아제 억제제입니다.
염화칼륨맥클린P816354-25지염화칼륨, KCI는 또한 칼륨 무리에이트 및 실바이트로 알려져 있으며, 776°C(1420 OF)에서 녹는 짠 맛을 가진 무색 결정질 고체입니다. 물에는 용해되지만 알코올에는 녹지 않습니다. 염화칼륨은 비료, 제약, 사진 및 소금 대용품으로 사용됩니다
)

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