전이성 자궁내막암 모델 모델링: 토끼 모델에서 림프절 전이를 동반한 자궁내막암을 생성하는 기법

초록

출처: Lauren Philp et al. 생체 내 증식 및 배양된 VX2 세포로 만든 후복막 림프절병증이 있는 정소성 자궁내막암 모델. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 토끼의 봉합된 자궁 뿔에 고도로 전이된 VX2 세포 현탁액을 주입하여 자궁내막암의 토끼 모델을 생성하는 방법을 보여줍니다. 이는 후복막 림프절 전이를 동반한 원발성 자궁내막암의 발생으로 이어집니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. in vitro VX2 세포주 생성

1. 토끼 대퇴사두근에서 VX2 종양을 채취하고 쥐 옆구리에서 성장합니다.
   1. 동결된 VX2 종양 블록(1cm x 1cm)을 해동하고, 메스 블레이드를 사용하여 배양 플레이트에서 다진 다음 소량의 Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)을 순차적으로 첨가하여 70μm 필터를 통해 걸러내어 모든 세포가 최종 부피 1mL로 변형되도록 합니다.
   2. 세포를 세고 0.9% 인산염 완충 식염수로 1 x 10⁷/mL 농도로 희석하고 멸균 튜브의 얼음에 넣습니다.
      메모: 종양 블록은 토끼 대퇴사두근에서 VX2 종양의 이전 증식으로부터 실험실 협력자로부터 얻었습니다.
   3. 암컷 흰 뉴질랜드 토끼 (체중 2.5-3.5kg)에 2-5 % 흡입 된 이소 플루란을 마취하고 주사 부위의 털을 제거한 다음 포비돈 요오드 용액으로 주사 부위를 청소합니다. 준비된 VX2 세포 현탁액 500μL(5 x 10,⁶ cells/mL)를 토끼의 대퇴사두근에 주입합니다. 10일째부터 토끼의 종양 성장을 임상적으로 모니터링합니다.
   4. 종양이 직경 1-1.5cm(캘리퍼스로 외부에서 측정)에 도달하면 수의사가 승인한 방법을 사용하여 토끼를 안락사시킵니다. 심박수와 호흡수를 포함한 활력 징후를 확인하여 안락사를 확인합니다. 베타딘 용액으로 해당 부위를 세척한 후 멸균 기구를 사용하여 종양을 절제합니다.
   5. 멸균 기구를 사용하여 생물 안전 캐비닛에서 메스 블레이드를 사용하여 10cm 조직 배양 접시에 종양을 작은 조각(0.2cm)으로 다집니다. 1.1.1단계에서 설명한 대로 1mL의 HBSS를 사용하여 70μm 세포 여과기에 종양 조각을 통과시킵니다. 세포를 계수하고 0.9% 식염수를 사용하여 희석하여 200μL에서 7.5 x 10⁵개의 세포를 얻습니다.
   6. 1L/min에서 4% 이소플루란을 사용하여 수컷 NOD SCID 감마 마우스(무게 25g)를 마취하고 2% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지합니다. 마우스가 마취되면 200 게이지 바늘을 사용하여 1.1.5 단계의 용액 27 μL를 마우스 측면의 피하 조직에 주입합니다.
2. VX2 세포의 in vitro 수확 및 패시징
   1. 캘리퍼스를 사용하여 종양이 직경 1cm에 도달할 때까지 일주일에 두 번 임상적으로 이종이식 성장을 모니터링합니다.
   2. CO₂ 챔버에 넣거나 4% 이소플루란 가스로 마취한 후 경추 탈구를 수행하여 마우스를 안락사시킵니다. 생물 안전 캐비닛에서 멸균 상태에서 종양을 절제합니다.
   3. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/Ham'ss F12+ 10% 소 태아 혈청(FBS) 배지 3mL가 포함된 6cm 조직 배양 접시에 메스로 종양을 1-2mm 조각으로 다집니다.
   4. 종양 조각에서 세포가 자라기 시작할 때까지 2일 동안 5% CO₂가 포함된 37°C 인큐베이터에 종양 조각을 방해하지 않고 그대로 두십시오. 그 후, 세포 밀도를 위해 광학 현미경으로 매일 배양된 플레이트를 확인합니다. 70% 밀도에 도달하면 플라스크에 0.05% 트립신 1mL를 첨가하고 37°C 인큐베이터에 다시 5분 동안 넣어 세포를 트립신화합니다.
   5. 6 mL의 DMEM/Ham'ss F12 + 10% FBS 배지로 트립신을 중화하고, 세포를 채취하여 4°C에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 3.5mL의 새로운 DMEM/Ham'ss F12 + 10% FBS 배지에서 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 씨 신선한 6cm 콜라겐 I 코팅 플레이트는 플레이트당 1.6 x 10⁶개의 세포로 플레이트를 코팅하여 약 50%의 세포 파종 밀도를 달성합니다.
      참고: 50% 세포 밀도는 부착 시 플레이트 표면적의 50%를 차지하는 세포를 나타냅니다.
   6. 조기 계대측정: 세포가 5회 계대배양될 때까지 위의 과정(트립신화, 시딩)을 반복한 다음 토끼 게놈 DNA와 마우스 게놈 DNA를 구별하기 위해 정량적 PCR 분석을 사용하여 PCR로 세포주 순도를 평가합니다(1.3.1-1.3.4 단계 참조).
      메모: 8번의 계대 후, 세포는 콜라겐이 코팅되지 않은 일반 부착 조직 배양 플레이트에서 증식할 수 있습니다.
   7. 바이알당 2 x 10⁶의 농도로 DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO에서 세포의 분취량을 계대, 트립신화 및 동결합니다. 실험에 필요할 때까지 세포를 액체 질소에 보관하십시오.
3. 생존 세포의 VX2 기원 확인:
   1. 정제된 게놈 마우스 및 토끼 DNA에서 표준 치료법을 만듭니다(단계 1.3.2 및 단계 1.3.3). LINE-1 retrotransposon element.
      의 두 번째 열린 판독 프레임 내에서 종 특이적 염기서열을 표적으로 하는 프라이머를 사용합니다. 메모: CRPV E6에 대한 프라이머 서열은 5's-GATCCTGGACCCAACCAGTG 및 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT입니다. LINE-1 레트로트랜스포손 요소가 사용되었습니다. 토끼 LINE-1에 대한 프라이머 서열은 다음과 같습니다: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC 및 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT 마우스 LINE-1에 대한 프라이머 서열: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG 및 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
   2. CRPV E6에 대한 표준 곡선을 생성하려면 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 키트를 사용하여 VX2 종양 세포 용해물을 정제합니다(Step 1.1.1). 상용 분석을 사용하여 이 DNA를 정량화합니다. 낮은 EDTA-TE 버퍼에서 225pg/μL에서 0.925pg/μL까지 6회 연속 희석을 수행합니다. 마우스 게놈 DNA에 대한 표준 곡선을 만들려면 125pg/μL에서 0.0125pg/μL까지 5회 희석하여 낮은 EDTA-TE 버퍼에 100μg의 상용 마우스 게놈 DNA를 희석합니다.
   3. 1.3.2단계의 샘플에서 나온 각 희석 용액에서 4μL를 웰에 넣고 PCR 열순환기에서 샘플을 실행합니다. 각 실행의 Cq 값을 웰당 DNA 양과 함께 사용하여 thermocycler 소프트웨어 자동 임계값 설정을 사용하여 표준 곡선을 계산합니다.
   4. 표준 qPCR 절차를 사용하여 열순환기에서 40주기의 2단계 주기(98°C 및 60°C)로 PCR을 수행합니다. 임계값을 설정하고 델타 Ct 값을 >35로 설정하여 rabbit VX2 세포주에서 마우스 오염을 최소화합니다. 각 반응의 총 부피는 10 μL였으며, 5 μL의 2x Mastermix, 250 nM에서 반응 중 최종 프라이머 농도의 1 μL의 정방향 + 역방향 프라이머, 4 μL의 DNA 샘플로 구성되었습니다 .
      메모: 임계값이 설정되고 델타 Ct 값이 >35로 설정되어 토끼 VX2 세포주에서 마우스 오염이 최소화되도록 합니다. qPCR에 의한 신뢰할 수 있는 검출을 위한 VX2 DNA의 권장 수준은 1-10pg입니다.

2. VX2 세포 배양 및 세포 현탁액 생성

1. VX2 세포(단계 1.2.7에서 동결)가 포함된 바이알을 37°C의 수조에서 1분 동안 해동하고 10mL의 배양 배지(1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신)가 있는 원추형 원심분리 튜브로 세포를 옮깁니다. 107 x g에서 8분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버리고 세포 펠렛을 9mL의 배지에 다시 현탁시킵니다.
2. 다시 부유한 세포를 대형 배양 플라스크로 옮깁니다. 37°C에서 흔들리지 않고 세포를 배양합니다.광학 현미경을 사용하여 매일 세포의 합류 여부를 확인하고 3일마다 배양 배지를 교체합니다.
3. 주입을 위한 배양된 VX2 세포 현탁액 생성
   1. 세포가 80% confluence에 도달하면 플라스크에 0.25% 트립신 3mL를 추가하여 세포를 트립신화합니다. 플라스크를 인큐베이터(37°C)에 5분 동안 놓습니다. 용액을 원뿔형 원심분리기 튜브에 옮기고 107 x g에서 8분 동안 원심분리기를 한 다음 상층액을 제거합니다.
   2. 세포 펠릿을 인산염 완충 식염수 9mL, 원심분리기로 3회 세척하고 위와 같이 상층액을 제거합니다. 세포를 계수하고 0.9% 인산염 완충 식염수로 4 x 10⁷ cells/mL 농도로 희석하고 얼음 위의 멸균 원추형 원심분리기 튜브에 넣습니다.
4. 주입을 위한 in vivo propagated VX2 cell suspension 생성
   1. 얼어붙은 VX2 종양 블록(1cm x 1cm)을 해동하고 메스 날을 사용하여 배양 플레이트에 다진 다음 1.1.1단계와 같이 70μm 필터를 통해 걸러냅니다. 소량의 HBSS를 순차적으로 첨가하여 모든 세포가 최종 부피 1mL에 대해 변형되도록 합니다. 세포 수를 세고 0.9% 인산염 완충 식염수로 1 x10⁷/mL 농도로 희석하고 멸균 튜브의 얼음에 넣습니다.
      메모: 종양 블록은 토끼 대퇴사두근에서 VX2 종양의 이전 증식으로부터 실험실 협력자로부터 얻었습니다.

3. 수술 모델 확립

1. 외과적 마취 및 수술 전 준비 확립
   1. 암컷 흰 뉴질랜드 토끼(2.5-3.5kg)를 아세프로마진(1mg/kg IM) 및 멜록시캠(0.2mg/kg SQ) 주사를 사용하여 계획된 수술 1시간 전에 투약합니다.암컷 흰 뉴질랜드 토끼(체중 2.5-3.5kg)에 2-5% 흡입된 이소플루란을 마취하고 주사 부위 위의 털을 제거하고 포비돈-요오드 용액으로 주사 부위를 청소합니다.
   2. 마취된 토끼를 후두 마스크 기도(LMA)를 사용하여 삽관하고 테이프로 제자리에 고정하고 흡입된 이소플루란 용량을 2-5% 사이로 적정하여 깊은 마취를 유지합니다. 활력 징후(호흡수, 모세혈관 보충, 산소 포화도(사용 가능한 경우)를 확인하고 통증을 암시하는 징후(움직임, 자극에서 물러남, 소음) 또는 가벼운 마취(움직임, LMA 튜브 씹기)를 모니터링하여 절차 전반에 걸쳐 정기적으로 외과적 마취를 모니터링합니다.
      메모: 이것은 외과적 마취를 모니터링한 경험이 있는 사람이 수행해야 합니다.
   3. 가장자리 등쪽 정맥에 22게이지 귀정맥 카테터를 삽입합니다. 피부 절개 수술 10분 전에 세파졸린(20mg/kg)을 정맥 투여합니다.
   4. 토끼를 수술대에 올려놓기 전에 골반과 복부에 머리카락을 자르고, 토끼를 수술대의 등쪽 위치에 놓습니다. 3단계 수술용 피부 준비제(베타딘 비누, 클로르헥시딘 용액, 베타딘 용액)를 사용하여 수술 부위를 청소합니다. 치골 위쪽을 랜드 마킹한 후 개복부 드레이프로 수술 부위를 덮고 하복부의 5cm x 5cm 영역을 노출시킵니다.
2. 개복술 절개 및 자궁 뿔의 식별 생성
   1. 수술용 모자와 안면 마스크를 착용하십시오. 클로르헥시딘 또는 베타딘 수술용 스크럽 용액을 사용하여 손을 문지릅니다. 멸균 기술을 사용하여 멸균 가운과 멸균 수술 장갑을 착용하십시오.
   2. # 11 블레이드 메스를 사용하여 토끼 복부의 피부와 피하 조직을 통해 치골 교감까지 2.5cm 길이의 절개 1cm 절개를 만듭니다. 직근근을 절개하고 직근을 측면으로 절개하여 아래에 있는 복막을 노출시킵니다. 아래 표면에 장이나 다른 복부 장기가 없는지 확인한 후 복막에 급격히 들어갑니다.
   3. 방광을 식별하는 자궁 뿔을 찾고 장갑을 낀 손가락을 방광 정점 위로 위, 후방, 옆으로 쓸어 넘깁니다.
      메모: 필요한 경우 디지털 압력을 사용하여 전체 방광을 비울 수 있습니다. 위치를 찾으면 복부 절개 부위를 통해 자궁 뿔을 복벽에 올려놓습니다.
   4. 3-0 꼰 흡수성 봉합사를 사용하여 자궁경부 원위부에서 약 1.5-2.0cm 떨어진 각 자궁 뿔을 단일 봉합 결찰술을 수행합니다. 봉합사를 자궁 동맥 바로 안쪽에 놓고, 자궁 동맥은 각 뿔의 측면을 따라 뻗어 있습니다. 봉합사를 꼭 맞게 묶어 원위 자궁 뿔을 막습니다(그림 1).
3. 근막 VX2 접종
   1. 27게이지 바늘을 사용하여 2.3.2단계(배양된 VX2 모델의 경우) 또는 2.4단계(생체 내 증식 VX2 모델의 경우)에서 이전에 준비한 VX2 세포 현탁액 0.5mL를 봉합사 부위(봉합사 부위와 자궁경부 사이)에 근접한 각 자궁 경각의 근막에 주입합니다. 1분에 걸쳐 주입하고 세포가 기저 자궁강에 주입되지 않는지 확인합니다.흡입된 이소플루란(2-5%)과 베인 회로가 있는 마취기를 사용하여 동물을 마취합니다.
   2. 주입 후 30초 동안 근막 주사 부위에 압력을 가하여 세포의 누출을 최소화합니다. 주사 및 봉합 부위에 지혈이 있는지 검사하고 자궁 뿔을 복부에 다시 삽입합니다.
4. 절개 부위 봉합
   1. 깊은 복벽 폐쇄: 복막 절개의 정점을 확인하고 조직 집게로 복막, 직근 근육 및 근막을 잡습니다.
      1. 이렇게 하려면 절개 부위의 한쪽 끝에서 표재성 깊숙한 곳으로, 다른 쪽 절개 부위에서 표재성 깊숙한 곳까지 봉합하여 절개 부위의 한쪽 정점에 봉합사를 고정합니다. 매듭을 묶습니다. 부착된 봉합사를 사용하여 절개 부위를 좌우로 절개 부위를 따라 단계적으로 작업하면서 복벽 층을 통해 절개 부위에 수직으로 실밥을 꿰매십시오. 봉합사를 묶고 자릅니다.
   2. 표재성 복벽 폐쇄: 피부 절개의 정점을 확인하고 매몰 실행 피하 3-0 흡수성 폴리 필라멘트 봉합사를 사용하여 복부 피부를 봉합합니다. 닫힌 절개 부위에 수술용 접착제를 바르고 피부 가장자리에 반대 방향으로 바릅니다.
      1. 이렇게 하려면 절개 부위의 한쪽 정점에 봉합사를 고정하여 절개 부위의 한쪽 면은 표재성 깊숙이 봉합하고 다른 쪽은 표재성 깊숙이 봉합합니다. 매듭을 묶습니다. 부착된 봉합사를 사용하여 절개 부위를 따라 좌우로 단계적으로 작업하면서 절개 부위와 평행하게 진피층을 꿰매십시오. 봉합사를 묶고 자릅니다.
5. 수술 후 관리
   1. 마취에서 깨어나기: 절개 부위가 닫히면 이소플루란을 끄고 토끼가 마스크로 산소를 호흡하도록 하면서 각성의 징후(예: 후두 마스크 기도에서 자발적인 움직임, 눈 뜨기 및 씹는 동작)를 모니터링합니다. 이러한 징후가 발견되면 토끼를 발관시키고 토끼가 정신을 차리고 독립적으로 앉을 수 있을 때까지 마스크와 따뜻한 담요로 산소를 공급합니다.
   2. 수술 후 모니터링: 4일 동안 하루에 두 번, 수술 후 추가로 10일 동안 매일 토끼를 모니터링합니다. 환자의 전반적인 상태, 음식 및 수분 섭취량, 소변 및 대변 배출량, 통증 평가, 체중, 활력 징후(심박수, 호흡수) 및 수술 부위를 모니터링하고 평가하여 부기, 홍반, 분비물 또는 탈구를 찾습니다.
   3. 수술 후 통증 조절: 수술 후 48시간 동안 매일 Meloxicam을 투여(0.2mg/kg SQ)한 다음 통증 평가에 따라 필요에 따라 투여합니다.수술 직후 부프레노르핀을 투여하고 24시간 동안 12시간마다(0.01-0.05mg/kg SQ) 이후 통증 평가에 따라 필요에 따라 투여
   합니다.
   4. 수의사의 권고에 따라 상처 감염을 예방하기 위해 수술 후 7일 동안 매일 항생제(엔로플록사신, 5mg/kg, IM)를 투여할 수 있습니다.탈수를 위해 하루에 두 번 피하수액(SQ 15mL)을 투여하고, 체중 감량을 위해 필요에 따라 부드러운 음식 또는 기타 식이 보조제를 매일 제공합니다.

결과

그림 1: 자궁 봉합. 검은색 화살표 = 봉합사, 빨간색 화살표 = 자궁 뿔.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
11날 메스, 멸균, 일회용	아스펜 서지컬(VWR)	80094-086
22-gague 귀 정맥 카테터	증권 시세	14332
3-0 흡수성 폴리 필라멘트 봉합사 (Polysorb)	코비디엔	356718
3-0 꼰 흡수성 봉합사 (Polysorb)	코비디엔	356718
70uM 셀 스트레이너, 개별 포장, 나일론	송골매	352350
아세프로마진(Atravet)	증권 시세	1047
베타딘 비누(포비오돈 요오드 7.5%)	증권 시세	4363
베타딘 용액 (포비오돈 요오드 10%)	UHN 스토어	457955
부프레노르핀	맥길 대학교
세파졸린	UHN 입원 환자 약국	고양이 # 필요 없음
클로르헥시딘 용액	증권 시세	119872
코닝 바이오코트셀웨어 콜라겐 I형, 100mm 접시	코 닝	354450	브랜드는 중요하지 않습니다.
코닝 BioCoatCellware, 콜라겐 타입 I, 24웰 플레이트	코 닝	354408	브랜드는 중요하지 않습니다.
코닝 바이오코트셀웨어, 콜라겐 I형, 6웰 플레이트	코 닝	354400	브랜드는 중요하지 않습니다.
코닝 마트리겔 베이스저 멤브레인 매트릭스, *LDEV-free, 10 mL	코 닝	354234
DMEM/햄 F12 1:1	생명 기술	11320	브랜드는 중요하지 않습니다.
디엠소	Caledon Lab Chem (칼레돈 랩 켐	4100년 10월 1
엔로플록사신(Baytril 주사제)	증권 시세	11242
팔콘 튜브	코닝 Centri-Star	430828
소 태아 세럼, 자격, 캐나다 원산지, 500ml	생명 기술	12483020	브랜드/출처는 중요하지 않습니다.
이소플루란	UHN 입원 환자 약국	고양이 # 필요 없음
이소헥솔 대비	GE 헬스케어	407141210
멜록시캠 (메타캠 0.5%)	증권 시세	104674
생리식염수	하우스 브랜드(UofT Medstore)	1011
PBS (PBS)	멀티셀 또는 시그마	331-010-CL 또는 D8537-500mL
페니실린/스트렙토마이신(100mL; 10000U 페니실린, 10000ug 스트렙토마이신)	코닝-셀그로	CA45000-652
멸균 행크 균형 소금 용액 (-Ca++, -Mg++, -페놀 레드)	T.C.M.F (브리스토 박사)	11-1-28
수술용 접착제(조직 접착제)	3M 베트본드	14695B
트립신(0.25%), 단백질체학 등급	시그마	T-6567-5X20UG
트립신-EDTA, 0.05%, 100ml	주식회사 위센트	325-542-엘	브랜드는 중요하지 않습니다.

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