이미징 질량 분석 분석을 위한 난소암 커뮤니케이션 모델링: 전이성 난소 종양 발달에서 소분자 화학 전달자를 식별하는 방법

초록

출처: Zink, K. E. et. al. 이미징 질량 분석기를 사용하여 조직과 세포 간의 소분자 통신 캡처. J. Vis. 특급 (2019)

이 프로토콜은 난소 절치와 나팔관 암 세포를 공동 배양하여 검체 준비 기술을 설명합니다. 이러한 샘플은 이미징 질량 분광법(IMS)을 사용하여 시각화하여 종양 발생으로 이어지는 세포와 조직 간의 소분자 교환을 감지합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. Cocultures를 위한 ITO 처리된 Slide 설정 및 인큐베이팅

1. 분열되지 않은 공동 문화
   1. 핫 플레이트에서 70 ° C에서 아가로 로즈를 액화합니다.
   2. 8웰 디바이더를 ITO(Indium tinoxide) 처리된 슬라이드 위에 놓습니다(그림 1A). 디바이더의 고무 바닥은 슬라이드에 대한 접착을 돕지만 아가로스 도금 중에는 웰 사이에 누출이나 혼합이 없도록 지속적으로 부드러운 하향 압력을 가해야 합니다.
   3. 15mL 코니컬 튜브, 원심분리기(800rpm에서 5분)에서 세포를 수집하고, 1x DMEM 배지에서 150μL당 50k 세포로 재현탁합니다. 다른 세포 밀도가 최적인 경우 이 단계에서 세포 현탁액이 원하는 최종 밀도의 2배인지 확인하십시오(예: 300μL에 50,000개 세포의 최종 농도에 대해 이 단계에서 세포 밀도는 150μL에 50,000개 세포임).
   4. 세포 배양을 플레이팅하기 전에 웰 중앙에 난소 외식술을 추가합니다(그림 1B).
   5. 도금 직전에 개별 2mL 튜브의 각 세포 배양에 아가로스를 추가합니다. 각 웰에 대해 200μL의 세포 현탁액과 200μL의 액화 아가로스를 2mL 튜브에 결합합니다. 예를 들어, 4개의 웰에 대해 800μL의 세포 현탁액과 800μL의 2% 아가로스를 결합합니다. 일부 혼합물이 남을 수 있지만 필요한 것보다 약간 더 많이 만들면 파이펫팅 중 기포를 방지할 수 있습니다.
      1. 해당 세포 배양을 플레이팅하기 직전에 개별 세포 배양에 아가로스를 첨가합니다. 아가로스는 1분 이내에 식을 것이므로 빨리 플레이트를 준비할 수 있습니다.
   즉시
   6. 300μL의 세포/아가로스 혼합물을 각 웰에 추가합니다(그림 1C). 그림 1C는 3개의 세포 상태와 1개의 매체 상태를 보여주며, 각각 난소가 있거나 없는 상태로 도금되어 있습니다.
   7. 가습 인큐베이터에서 37 °C 및 5% CO₂로 슬라이드를 배양합니다.
2. 분열된 공동 문화
   1. 얇고 매끄러운 플라스틱으로 칸막이를 자릅니다(그림 2A).
      메모: 이 실험은 멸균 일회용 매체 대야의 측면이 평평하고 얇기 때문에 사용합니다. 우물의 빗변에 꼭 맞을 정도로 넓게 자릅니다 (~ 13mm).
   2. 핫 플레이트에서 70 ° C에서 아가로 로즈를 액화합니다.
   3. ITO 처리된 슬라이드 위에 8웰 디바이더를 놓습니다(그림 2B). 디바이더의 고무 바닥은 슬라이드에 대한 접착을 돕지만 아가로스 도금 중에는 웰 사이에 누출이나 혼합이 없도록 지속적으로 부드러운 하향 압력을 가해야 합니다.

2. 건조 슬라이드 및 MALDI-TOF MS 준비

1. 4일(또는 원하는 시점) 후 아가로스 플러그와 슬라이드에서 챔버 디바이더를 제거합니다(그림 1D). 평평한 주걱으로 챔버에서 아가로스의 측면을 부드럽게 분리하고 아가로스 플러그를 움직이지 않도록 주의하면서 챔버를 부드럽게 위로 당깁니다. 움직이면 서로 닿지 않도록 부드럽게 위치를 조정하십시오.
2. 슬라이드를 37°C 오븐에 약 4시간 동안 넣고 매시간 90° 회전합니다.
   메모: 슬라이드의 회전은 샘플 전체에 균일한 열 분포를 보장하는 데 중요합니다.
3. 건조되면 오븐에서 슬라이드를 꺼냅니다(그림 1E).
4. 분무기(그림 1F)를 사용하여 온도 = 30°C, 유속 = 0.2mL/분, 통과 횟수 = 8, 방향 = CC, 노즐 거리 = 40mm.
   매개변수와 함께 매트릭스 용액을 도포합니다. 메모: 매트릭스 분무기 대신 예술적인 에어브러시를 사용하여 액체 매트릭스를 적용할 수 있습니다. 동일한 매트릭스 용액을 사용하여 분무할 수 있지만 약 두 배의 용액이 필요합니다. 슬라이드가 수직으로 매달리도록 고정한 상태에서 매트릭스 층이 보일 때까지 약 1피트 떨어진 90° 각도에서 슬라이드를 분사합니다.
5. 1μL의 캘리브런트(<500Da)의 경우 Phosphorus Red, 5,000Da<타겟)의 경우 펩타이드 혼합물(재료 표 참조)을 추가하여 슬라이드의 반점을 제거합니다. Phosphorus Red는 매트릭스와 혼합할 필요가 없지만 펩타이드 혼합물은 이온화를 돕기 위해 매트릭스와 1:1 혼합물이 필요합니다. 교정제가 마를 때까지 기다립니다.
6. 슬라이드의 각 모서리에 있는 영구 마커를 사용하여 X를 그리고 카메라나 스캐너를 사용하여 1,200dpi의 광학 이미지를 촬영합니다.

결과

그림 1: 분할되지 않은 공동 배양의 시료 준비를 위한 워크플로우. (A) ITO 코팅된 슬라이드의 전도성 면에 8웰 챔버를 부착합니다. (B) 공동 배양 조건을 위해 반으로 자른 난소를 우물 중앙에 배치합니다. (C) 300μL의 아가로스/세포 현탁액을 웰에 직접 첨가합니다. 기포가 없고 난소가 우물 중앙에 남아 있는지 확인하십시오. 피펫 아가로스가 난소를 방해한 경우 아가로스가 식기 전에 피펫 끝을 부드럽게 사용하여 난소 중앙에 놓습니다. (D) 배양 4일(또는 최적화된 시간) 후 슬라이드에서 8웰 챔버를 제거합니다. 아가로스가 챔버에 부착된 상태로 남아 있으면 주걱을...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
덴빌	C1017-O	세포를 수집하려면
밀리포어	PEZGS0816	Millipore Millicell 에서 용도 변경 EZ-슬라이드 챔버 슬라이드
시그마-알드리치	34998-4L	스프레이 매트릭스용 용제
에펜도르프	5810 R	세포를 수집하고 제거하려면 상쾌한
브루커 달토닉	8201344	건조된 슬라이드에 분사되는 매트릭스
브루커 달토닉	8201346	건조된 슬라이드에 분사되는 매트릭스
지브코	11995-065	아가로스와 혼합된 미디어
제네시 사이언티픽	22-282	아가로스 부분 표본의 경우
브루커	8237001	공동 배양 인큐베이션을 위한 플랫폼
시그마-알드리치	A9414-10G	도금을 위한 매체와 혼합
코 닝	4870	플라스틱 칸막이를 자르는 데 사용됩니다 분할된 챔버
브루커 달토닉	8206195	중간 질량 범위를 위한 Calibrant
시그마-알드리치	343-242-5지	낮은 질량 범위를 위한 Calibrant
심가-알드리치	E2758	세포 배양 배지 보충제
(주)페프로텍	100-15	세포 배양 배지 보충제
셀그로	30-005-크롬	세포 배양 배지 보충제
시그마-알드리치	11074547001	세포 배양 배지 보충제
지브코	제25030-081	세포 배양 배지 보충제
지브코	15140-122	세포 배양 배지 보충제
피셔 테크놀로지	답116-50	매트릭스 솔루션에 추가됨
HTX 기술		매트릭스 적용용

조 년 년 년 년 호 년 스