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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 골드 나노 스타 코어 합성
참고: 금 나노스타는 이 실험에 사용된 두 가지 맛의 SERRS 나노프로브의 코어로 사용됩니다.
- 탈이온수(DI)에 60mM 아스코르브산(C6, H,8, O6) 용액 800mL를 준비하고 DI 물에 20mM 테트라클로로아우르산(HAuCl4) 용액 8mL를 준비합니다. 4 °C로 식히십시오.
- 이 반응 단계를 4°C에서 수행합니다.아스코르브산 용액 800mL가 들어 있는 원뿔형 플라스크를 자기 교반 플레이트에 놓고 일정한 와류를 유도합니다. 8mL의 테트라클로로오우르산 용액을 소용돌이에 빠르게 첨가합니다. 몇 초 안에 나노 별이 형성되고 용액은 짙은 파란색을 띠게됩니다. 언제든지 색상이 분홍색 또는 자주색이 되어 나노구체의 형성을 의미하면 현탁액을 버리고 합성을 다시 시도해야 합니다.
- nanostar 현탁액을 50mL 코니컬 튜브에 붓고 20분(4°C, 3,220 x g) 동안 원심분리기를 합니다. 각 튜브에 약 200μL의 용액을 남기고 상층액을 흡입합니다. 튜브 바닥에 있는 나노 입자 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.
메모: 상등액은 남아 있는 부유 나노스타 때문에 파란색 색조를 가져야 합니다.
- 마이크로피펫을 사용하여 용액을 교반하여 각 튜브에서 나노 입자를 현탁하고 수집합니다. 펠릿의 일부는 튜브 바닥에 압축될 수 있으며 격렬한 피펫팅으로도 다시 부유하지 않습니다 – 이 부분은 버리십시오.
- 나노 입자 현탁액을 투석 카세트(MWCO 3.5kDa)로 옮기고 2L의 DI 물에 대해 최소 3일 동안 투석하고 매일 물을 교체합니다. 나노 스타를 4 ° C에서 투석하여 최대 한 달 동안 보관하고 3-4 일마다 물을 갈아줍니다 .
메모: 나노스타는 섹션 2에 설명된 대로 실리케이트 반응에 필요할 때까지 투석을 받아야 합니다.
2. 실리카 껍질의 형성
참고: 두 가지 맛의 라만 나노프로브가 합성됩니다. 합성 절차는 둘 다 동일하지만 유일한 차이점은 사용된 라만 리포터 분자(염료)입니다. 이 실험에서는 IR780 과염소산염 및 IR140이 사용됩니다. 반응은 항상 플라스틱 용기에서 수행되어야 합니다. 합성은 확장성이 뛰어나며 필요한 주입량에 맞게 조정할 수 있습니다. 여기에서는 중간 배치 합성에 대해 설명하며, 이는 동일한 농도 및 반응 시간으로 필요에 따라 더 낮거나 더 높은 부피로 선형으로 확장될 수 있습니다. 두 가지 SERRS 나노 프로브 유형에 대한 반응은 병렬로 수행 할 수 있습니다. 교차 오염을 피하도록 주의하십시오. 세척 단계 중 원심분리 후 또는 나노 입자를 1시간 이상 보관한 후 나노 입자 펠릿의 재분산을 위해 초음파 처리를 수행해야 합니다. 초음파 처리는 나노 입자가 용액에 명확하게 현탁 될 때까지 일반적으로 1 초 동안 수행해야합니다.
- 튜브 A(50mL 코니컬 튜브)에서 이소프로판올 10mL, TEOS 500μL, DI water 200μL 및 염료 60μL(IR780 과염소산염 또는 IR140, DMF(디메틸포름아미드) 중 20mM)를 혼합합니다.
- 튜브 B(15mL 원추형 튜브)에서 3mL의 에탄올과 200μL의 수산화암모늄을 혼합합니다. 1.4단계에서 나노스타를 초음파 처리하여 용액의 모든 클러스터를 분산시키고 튜브에 1.2mL의 나노스타를 추가합니다.
참고: 수산화암모늄 용액은 휘발성이 높아 정확하게 파이펫팅하기 어렵습니다. 피펫팅을 용이하게 하기 위해 필요할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
- 튜브 A를 와류 믹서에 놓고 일정한 와류를 유도합니다. 튜브 B의 내용물을 소용돌이에 빠르게 추가하고 약 5초 동안 계속 혼합합니다. 즉시 셰이커로 옮기고 실온에서 300rpm으로 흔들면서 15분 동안 반응하도록 합니다.
- 15분 배양 후 에탄올을 첨가하여 50mL 튜브를 채워 반응을 소멸시킵니다. 3,220 x g 및 4 °C에서 20분 동안 원심분리기.
- 상등액을 흡입하고 약 0.5mL의 용액을 남기고 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 에탄올 1mL를 넣고 피펫으로 교반하여 나노 입자를 재현탁시킵니다. 1.5 mL 원심 분리 튜브로 옮기고 11,000 x g에서 4 분 동안 원심 분리하여 에탄올로 4 회 세척하고 상층액을 흡입하고 약 1 초 동안 초음파로 펠렛을 재현탁시킵니다.
- 참고: 이 단계에서 규산된 나노 입자는 섹션 3에 설명된 대로 기능화되거나 추가 세척 단계를 통해 DI 물에 재현탁하여 4°C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다.
3. 표면 기능화
참고: IR780 SERRS 나노프로브는 PEG 교차결합제를 통해 엽산 수용체 표적 항체와 접합되어 αFR-NP를 형성합니다. IR140 SERRS 제어 나노프로브는 nt-NP용 부동태화 PEG 단층과 결합됩니다. 두 가지 맛은 별개이지만 평행 반응에서 티올-말레이미드 반응을 통해 형성됩니다.
- 11,000 x g에서 4분 동안 원심분리하여 나노 입자를 두 번 세척하고, 상층액을 흡인하고, 초음파에 의해 1mL의 에탄올에 펠렛을 재현탁시킵니다. 세척 단계를 한 번 더 반복하되 85% 에탄올 1mL, 10% 3-MPTMS(3-메르캅토프로필트리메톡시실란) 및 5% DI 물에 재분산시킵니다. 실온에서 1-2시간 동안 배양하여 입자 표면에 티올을 주입합니다.
- 11,000 x g에서 4분 동안 원심분리하고, 상층액을 흡인하고, 초음파로 펠릿을 재현탁시키고, 에탄올에서 2회, DI에서 2회, 마지막으로 HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 완충액(10mM, pH 7.1)에서 티올 기능화 나노입자를 세척하고 따로 보관합니다.
- 참고: MES(2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산) 완충액 또는 HEPES를 사용해야 합니다. PBS(인산염 완충 식염수)와 같이 염도가 높은 완충액은 나노입자 응집을 유도할 수 있습니다.
- 항체 기능화 αFR-NP의 경우, 200μg의 항체(항엽산 결합 단백질 항체 클론[LK26])를 500μL의 MES 완충액(10mM, pH 7.1)에서 10배 이상의 PEG 가교제(폴리(에틸렌 글리콜)(N-하이드록시숙신이미드 5-펜타노에이트) 에테르 N'-(3-말레미도프로피오닐) 아미노에탄(CAS: 851040-94-3), 디메틸 설폭사이드(DMSO))와 30분 동안
반응시킵니다.
- 원심필터(MWCO 100 kDa)에서 항체-PEG 용액을 원심분리하여 과도한 가교제를 제거하고 항체를 농축합니다. 이 연구에 사용된 원심 필터의 경우 14,000 x g 및 23°C에서 10분 동안 원심분리를 수행합니다. 필터를 뒤집고 1,000 x g에서 2분 동안 원심분리하여 새 튜브에서 접합된 항체를 회수합니다.
- 3.2단계의 IR780 나노입자를 항체와 함께 튜브에 피펫팅하고 피펫으로 교반하여 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 최소 30분 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 αFR-NP를 형성합니다.
- nt-NP를 형성하기 위해 3.2 단계의 IR140 SERRS 나노 입자에 DMSO에 용해 된 1 % w / v 메 톡시 말단 (m) PEG5000-maleimide (CAS : 99126-64-4)를 첨가하고 실온에서 최소 30 분 동안 또는 4 ° C에서 밤새 500 μL MES 완충액 (10 mM, pH 7.1)에서 반응시킨다.
- 마우스에 투여하기 위해(섹션 4), 11,000 x g에서 4분 동안 두 나노프로브 향을 모두 스핀다운하고, 상등액을 흡인하여 유리 미반응 항체/PEG로 용액을 제거하고, MES 완충액(10mM, pH 7.1)에서 각 향을 600pM 농도로 재분산합니다. 나노입자를 재현탁할 때 항체의 변성을 방지하기 위해 초음파에 대한 불필요한 노출을 최소화합니다.
4. 나노 프로브 주입 및 이미징
- 섹션 1-3에 설명된 대로 나노프로브(αFR-NP 및 nt-NP)를 준비하고 MES 완충액(10mM, pH 7.1)에서 각 유형의 최종 농도 300pM에 대해 1:1 비율로 혼합합니다. 선택적으로, 작은(100μL) 원뿔형 튜브에서 각 나노프로브 맛의 30pM에 대한 참조 표준물질을 준비합니다.
- 각 마우스에 1mL의 나노 입자 현탁액을 복강내 주입하고 배를 부드럽게 마사지하여 나노 입자가 복막강 내에 분포되도록 합니다. 마우스를 하우징으로 되돌립니다. 25분 이상 경과한 후 CO2 질식을 통해 마우스를 안락사시킵니다.
- 누운 위치에서 수술 플랫폼에 마우스를 고정합니다(전체 복부 이미징의 경우 플랫폼은 정립 현미경 스테이지에 장착할 수 있어야 함).
- 톱니 모양의 집게와 해부 가위를 사용하여 피부를 제거하여 복막을 드러내고 큰 시상 절개 (길이 2-3cm)를 수행하여 복부 전체를 노출시킵니다. 복막 플랩을 플랫폼에 부착합니다. 플라스틱 분무기를 사용하여 최소 60mL의 PBS로 복막강 내부를 씻습니다.
참고: 복부 전체를 방해받지 않고 촬영할 수 있으려면 장을 동원하거나 절제해야 합니다. 절제의 경우, 복강으로의 출혈을 줄이기 위해 장간막 혈관의 결찰로 절제합니다.
- 또는 특정 장기를 이미지화하려면 PBS 세척 후 절제하고 현미경 슬라이드에 놓습니다.
- 플랫폼 또는 슬라이드를 직립 광학 구성과 이미징을 위한 전동 스테이지가 있는 라만 마이크로분광 광도계로 옮기십시오. 1,115cm-1을 중심으로 mm당 1,200개의 홈이 있는 격자가 있는 300mW 785nm 다이오드 레이저가 있는 상용 시스템을 사용하십시오.
- Raman 레이저와 동초점인 백색광 광학 장치를 사용하여 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 이미지화할 영역과 원하는 해상도를 선택합니다. 이 보고서에서는 고속 획득 모드(유효 공간 해상도 14.2μm x 200μm, 5배 배율, 대물렌즈에서 100mW 출력, 포인트당 <100ms 노출)를 사용하여 현미경 스테이지가 지속적으로 움직이는 연속 레이저 조명 하에서 획득한 스펙트럼)이 사용되었습니다.
메모: 원하는 경우 Step 4.1의 참조 나노프로브가 있는 튜브를 이미징된 영역 내에 배치하여 후속 분석을 위한 내부 참조 표준을 제공할 수 있습니다. 레이저 이외의 외부 광원이 대물렌즈에 도달하지 않도록 하십시오.
- 선택적으로, 4°C에서 하룻밤 동안 PBS의 4% 파라포름알데히드에 고정하여 조직학적 처리 및 검증을 위해 샘플을 준비합니다. 4°C에서 15분 동안 PBS로 최소 두 번 헹굽니다. 표준 조직학적 처리 및 파라핀 포매가 완료될 때까지 샘플을 70% 에탄올에 담근 상태로 물에 보관하십시오. 종양의 조직학적 검증을 위해 파라핀 블록의 서로 다른 깊이에서 나온 절편(5μm 두께)을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색할 수 있습니다.