근위 배양 시스템: 세포 간의 부분비 신호 전달을 연구하기 위한 체외 배양 기술

A. 세포 준비

1. 인간 1차 중피 세포의 분리 및 배양
   1. 인간 망막에서 인간 1차 중피 세포(HPMC)를 분리하고 37°C 및 5% CO₂.
      에서 완전한 성장 배지[10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 1% 비필수 아미노산 및 1% 비타민을 함유한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)]에서 성장시킵니다. 메모: HPMC는 일반적으로 100% 합류점으로 성장합니다(그림 1A).
2. 난소암 세포의 성장 조건
   1. 37°C 및 5% CO₂.
      에서 완전한 성장 배지에서 HeyA8 난소암 세포를 성장시킵니다. 메모: 약 80% 합류점으로 성장한 HeyA8 세포를 사용합니다(그림 1B).

B. 세포 배양

1. 근위 배양 설정
   1. 0.4μm 공극(10⁸공극/cm²) 및 4.67cm² 성장 면적이 있는 10μm 두께의 조직 배양 처리된 폴리카보네이트 멤브레인이 있는 6웰 플레이트에 Transwell 인서트를 사용합니다. 필요한 경우, 성장 표면적에 따라 파종된 세포의 수를 조정하여 다양한 삽입 크기에 맞게 최적화합니다. 사용하기 전에 완전 성장 배지, 트립신 및 인산염 완충 식염수(PBS)를 37°C로 가열합니다.
2. 인서트 준비
   1. 인서트 멤브레인의 아래쪽 표면에 HeyA8 세포를 시드하려면 멸균 집게를 사용하여 포장에서 인서트를 제거하고 15cm 배양 접시에 거꾸로 놓습니다.
   2. 거꾸로 된 인서트를 수용할 수 있는 깊이가 있는 15cm 접시를 사용하거나 적절한 멸균 용기로 대체하십시오. 실험에 따라 15cm 접시에 필요한 수의 인서트를 넣으십시오.
   3. 그에 따라 3개의 대조군과 3개의 실험 조건에 삽입물의 가장자리에 있는 마커로 레이블을 지정합니다.
3. 암세포 준비
   1. 25cm² 플라스크(~2 x 10⁶ 세포)에서 80% 합류로 성장한 HeyA8 세포를 트립신화하려면 1mL의 트립신(0.25%)을 40-60초 동안 첨가하고 6mL의 완전 성장 배지로 트립신을 중화합니다.
   2. 실온(RT)에서 500 x g의 세포를 3분 동안 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포 펠렛을 5mL의 완전 성장 배지에 재현탁합니다. trypan blue 염료 배제 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다.
4. 암세포 파종
   1. 완전한 성장 배지에서 100,000 cells/mL의 살아있는 HeyA8 세포를 현탁시킵니다. 인서트 바닥에 있는 800μL의 완전한 성장 배지에 현탁된 80,000개의 HeyA8 세포를 조심스럽게 파종합니다(거꾸로 되어 있기 때문에 이제 위를 향하고 있음).
   2. 세포가 삽입물에 남아 있도록 세포를 돔 모양으로 시딩합니다(그림 1C). 멤브레인의 중심에서 시작하여 천천히 피펫팅하면서 동심원을 그리며 바깥쪽으로 이동합니다. 매체가 쏟아지는 것을 방지하기 위해 가장자리에서 3mm 이상 떨어지지 마십시오.
      메모: 파종된 세포의 수는 세포의 성장 속도와 실험 기간에 따라 달라집니다. 이 근위 배양을 위해 파종된 HeyA8 세포의 수가 최적화되었으며, 세포는 3일째가 끝날 때 80-90% 융합될 것입니다.
5. 암 세포 부착
   1. 15cm 접시를 덮고 인서트가 들어 있는 접시를 CO₂ 인큐베이터로 조심스럽게 옮깁니다. 이 단계에서 인서트에서 매체와 세포의 드롭을 방해하지 않는 것이 중요합니다. 암세포가 삽입물에 부착될 수 있도록 세포를 37°C에서 4시간 동안 그대로 둡니다.
6. 중피 세포 준비
   1. 약 4시간 후, 75cm² 플라스크(~4 x 10⁶ 세포)에서 100% confluence로 성장한 HPMC를 2mL의 트립신(0.25%)으로 1-2분 동안 트립신화하고 12mL의 완전 성장 배지로 트립신을 중화합니다.
   2. 500 x g의 RT에서 3분 동안 세포를 원심분리하고, 10mL의 완전 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁하고, trypan blue 염료 배제 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다.
7. 중피 세포 파종
   1. 완전한 성장 배지에서 300,000 cells/mL의 살아있는 HPMC를 현탁시킵니다. 2.5mL의 새로운 완전 성장 배지를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 인서트가 들어있는 15cm 접시를 생물 안전 후드로 조심스럽게 가져옵니다. 멸균 겸자를 사용하여 인서트를 뒤집어 6웰 플레이트의 웰에 놓고 HeyA8 세포를 완전한 성장 배지에 담근 상태로 아래쪽 표면에 부착한 상태로 똑바로 세웁니다(그림 1C).
   2. HeyA8 세포가 웰 바닥을 향한 표면에 부착된 삽입물 내부의 1.5mL 성장 배지에 현탁된 450,000개의 HPMC를 시드하거나(그림 1C) HPMC 대조군을 위한 HeyA8 세포가 없는 삽입물에 파종합니다. 세포가 없는 성장 배지 1.5mL를 HeyA8 대조군에 추가합니다.
8. 근위 배양 성장
   1. 근위 배양물을 37°C에서 CO₂ 와 72 시간 동안 5% CO₂ 에서 성장시킵니다. 필요한 경우 배지를 다음과 같이 보충할 수 있습니다.
      1. 인서트 내부에서 750 μL를 제거하고 750 μL의 새로운 완전 성장 배지를 추가합니다.
      2. 인서트 외부(6웰 플레이트)의 경우 1mL를 제거하고 1mL의 새로운 완전 성장 배지를 추가합니다. 1mL는 한 단계로 배지를 변경하는 편의를 위해 선택되었습니다. 원하는 경우 1.25mL를 제거하고 대신 교체할 수 있습니다.

그림 1: 근위 배양 시스템의 조립.(A) 이 패널은 인간 1차 중피 세포(HPMC)를 보여줍니다. (B) 이 패널은 HeyA8 난소암 세포를 보여줍니다. 스케일 바 = 200μm(A-B). (C) HeyA8 세포를 0.4μm 공극을 가진 트랜스웰 삽입체의 하부 표면에 파종했습니다. 세포가 부착되면, 삽입물을 성장 배지를 포함하는 6-웰 플레이트의 웰에 배치하였다. 그런 다음 중피 세포를 삽입물에 파종하여 상부 표면에 부착하고 멤브레인에 의해 HeyA8 세포에서 분리했습니다. 멤브레인의 0.4μm 기공은 분비 인자의 교환을 허용했지만 세포 간의 직접적인 접촉을 억제했습니다.