복강내막의 난소암 전이 모델링: 복막강 내막의 체외 3D 모델을 확립하는 방법

초록

출처: Peters, P. N. et al. 인간 복막강의 유기형 배양에서 난소암 보급의 초기 단계 모델링. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오에서는 복막강 내막의 체외 3차원 모델 개발을 보여줍니다. 이 유기형 배양은 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 유기형 문화의 도금

1. 75cm² 배양 플라스크에서 10ml의 PBS로 헹구고 3ml의 0.25% 트립신/25mM EDTA를 5분 이상 사용하지 않고 추출합니다. 전체 성장 배지 부피의 3배 이상으로 트립신을 중화합니다.
2. 트립신화된 세포를 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 0.5g x 3분의 속도로 스핀다운합니다. 상층액을 제거하고 5ml의 완전 성장 배지에서 세포를 다시 끌어올립니다. 세포 계수기를 사용하여 배양 플라스크에서 회수된 세포를 계수합니다.
3. 세포를 적절한 부피의 완전 성장 배지로 희석하여 100μl당 2,000-4,000 NOF를 바닥이 투명한 검은색 96웰 플레이트에 플레이트합니다. 도금하기 전에 0.5 μg/100 μl의 쥐꼬리 콜라겐 I을 세포 혼합물에 첨가합니다. 세포를 가습 환경에서 37 % CO₂ 에 37 ° C에서 최소 4 시간 동안 또는 세포가 플레이트 표면에 부착 될 때까지 그대로 두십시오.
4. 1.1단계 및 1.2단계에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 배양 플라스크에서 HPMC(1차 인간 중피 세포)를 방출합니다. 96-웰 플레이트에 콜라겐 I으로 이미 도금된 NOF 위에 50μl당 10,000-20,000HPMC를 플레이트하기 위해 적절한 양의 완전 성장 매체로 세포를 희석합니다. 실험을 시작하기 전에 세포를 가습 환경에서 37 % CO₂ 에 37 ° C로 최소 18 시간 동안 방치하십시오.
5. 완전 성장 배지에서 HeyA8 난소암 세포를 발현하는 녹색 형광 단백질(GFP) 배양. HeyA8 난소암 세포는 요각류 cGFP(pCDH-CMV-MCS-EF1)를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 발현에 의해 형광 표지됩니다. HeyA8 난소암 세포는 사용 당일(대수 성장 단계)에 80-90% 융합되어야 합니다. 배양 플레이트에서 세포를 분리하고 일차 세포에 대해 1.1-1.2단계에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 계수합니다.
6. 난소암 세포가 뚜껑을 느슨하게 밀봉한 원뿔형 튜브에서 37°C에서 15-20분 동안 완전히 자라는 배지에서 회복되도록 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS (PBS)	피셔 사이언티픽	SH3001304
15cm 배양 접시	BD 바이오사이언스	353025
L-글루타민을 함유한 DMEM	코 닝	10-013-이력서
MEM 비타민	코 닝	25-020-CL
MEM 비필수 아미노산	코 닝	25-025-CI
페니실린-스트렙토마이신	코 닝	30-002-CI
셰이 커	써모 피셔	맥스Q 4450
원심 분리기	에펜도르프	5702
부 화기	써모 피셔	Forma 시리즈 II 워터 재킷 CO2 인큐베이터 Model 3100
트립신 EDTA, 1x (0.25%)	코 닝	25-053-CI
T-75 플라스크	BD 바이오사이언스	353136
T-175 플라스크	BD 바이오사이언스	353112
피펫 팁	라이닌	P2, P10, P20, P200 및 P1000
피펫 팁	코 닝	필터 팁 P2, P10, P20, P200 및 P1000
세포 계수기	인비트로젠	여자 백작
백작 부인 세포 계수 챔버 슬라이드	인비트로젠	C10313
트리판 블루 스테인 (0.4%)	지브코	제15250-061
콜라겐 타입 I (쥐 꼬리)	BD 바이오사이언스	354236
96웰 플레이트, 투명 바닥, 검은색	BD 바이오사이언스	353219

년 호