Mesothelial Cell Isolation: A Technique to Isolate Primary Mesothelial Cells From Human Omentum Tissue Specimen

초록

출처: Peters, P. N. et al. 인간 복막강의 유기형 배양에서 난소암 보급의 초기 단계 모델링. J. Vis. 특급 (2015년)

이 비디오는 인간 망막 표본에서 일차 인간 중피 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 중피 세포는 난소암 세포의 부착, 침입 및 증식을 조사하기 위한 체외 난소암 모델을 확립하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 1차 비형질전환된 기질세포의 분리 및 배양

1. 인체 조직 수집 및 준비.
   1. 복부 수술 중 제거된^2cm3의 인간 망막 표본을 채취하고 즉시 조직을 RT 인산염 완충 식염수(PBS)에 담급니다(그림 1A). 3cm x 2cm의 망막 조각은 일반적으로 100만 개의 일차 인간 중피 세포(HPMC)와 200,000개의 일차 인간 섬유아세포 또는 정상 난소 섬유아세포(NOF)를 생성합니다.
   2. 채취 후 가능한 한 빨리 조직을 0.5 x g에서 3분 동안 침<하고(PBS에서 2시간 ) PBS를 50ml 원뿔형 튜브에 담근 후 조직을 새로운 20ml PBS로 옮겼습니다. 직경 15cm의 멸균 배양 접시에 메스로 다져 조직을 5mm3 조각으로 자릅니다(그림 1B).
2. 1차 인간 중피 세포 분리
   1. HPMC를 분리하려면 다진 조직을 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 단단한 조각이 위로 떠오를 때까지 1분 동안 기다립니다(그림 1C 및 D). HPMC와 적혈구(RBC)는 바닥의 액체에 존재합니다. 피펫을 사용하여 튜브 바닥에서 액체를 제거하고 새 원뿔형 튜브에 넣습니다. 액체를 0.5 x g에서 3분 동안 회전시키고 HPMC/RBC 펠릿에서 상등액을 흡입합니다.
      1. 다진 조직에 20ml PBS를 넣고 조직이 부풀어 오르도록 한 다음 피펫으로 바닥에서 액체를 제거하고 HPMC/RBC 튜브로 넣고 스핀다운하고 상등액을 제거하는 과정을 세 번 반복합니다. 모든 스핀이 완료되고 상등액이 흡인된 후 펠릿에는 HPMC와 RBC가 포함됩니다.
   2. 펠릿의 모든 세포를 15ml의 완전 성장 배지(10% 소 태아 혈청[FBS], 1% MEM 비타민[93mg/L], 1% MEM 비필수 아미노산[81.4mg/L], 1% 페니실린 스트렙토마이신[Pen-Strep, 100U/ml 페니실린 및 100μg/ml 스트렙토마이신])에 포함된 75cm² 플라스크
   에 플레이트화합니다.
   3. 2차 PBS 세척을 수행하여 추가 HPMC를 분리합니다.
      1. 2차 PBS 세척의 경우 PBS 20ml에서 200rpm, 37°C에서 10분 동안 남은 고형 조직을 흔든 다음 조직이 위로 떠오를 때까지 1분 동안 기다립니다. 튜브 바닥의 액체를 새 튜브로 제거하고 0.5 x g에서 3분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡입합니다.
      2. 2차 PBS 세척의 모든 HPMC/RBC를 15ml의 완전 성장 배지에 별도의 75cm² 플라스크에 플레이트
      화합니다.
   4. 남아 있는 HPMC를 분리하려면 1:1 0.25% 트립신 25mM EDTA:PBS 용액 20ml에서 다진 조직을 200rpm, 37°C에서 10분 동안 흔듭니다. 조직이 부풀어 오르도록 하고 튜브 바닥의 액체를 새 50ml 튜브에 모은 다음 0.5 x g에서 3분 동안 아래로 돌립니다.
      1. 상층액을 흡인하고 모든 HPMC/RBC를 15ml의 완전 성장 배지에 75cm² 플라스크에 별도의 플레이트로 만듭니다.
   5. 가습 환경에서 37°C 및 5%_CO2에서 도금된 세포를 배양합니다. 사용한 배지를 제거하지 않고 3일과 5일에 15ml의 완전 성장 배지를 추가하여 도금된 세포를 공급합니다. HPMC는 분해하기 전에 5-7일 동안 배양할 수 있습니다.
      1. 모든 실험에서 low-passage HPMC(최대 통과 2)를 사용하여 원래 표현형의 역분화 및 변형을 최소화합니다. 모든 세포 이미지를 촬영하려면 플라스틱 미분 간섭 대비 기능이 있는 20x 대물렌즈 또는 위상차 기능이 있는 4-20x 대물렌즈(현미경의 위상차 필터)가 있는 광시야 현미경을 사용하는 것이 좋으며, 명시야에서 10x 대물렌즈()를 사용하여 면역조직화학 물질 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 염색을 분석하는 것이 좋습니다.
   6. HPMC가 직육면체임을 확인하고 면역조직화학을 수행하여 사이토케라틴 8 및 비멘틴을 발현합니다(그림 2A, C, E).

결과

그림 1. 일차 인간 난소 세포의 분리. (A) PBS의 수술 시 오멘텀 조각을 채취하여 실험실로 운반합니다. 조직은 0.5 x g x 3분의 속도로 펠렛화되어 새로운 PBS로 옮겨집니다. (B) 오멘텀 조각을 10cm 페트리 접시에 옮겨 PBS로 씻고 메스를 사용하여 오멘텀을 작은 조각(0.5cm3)으로 자릅니다. (C-D) 조직 조각은 25ml 혈청학적 피펫을 사용하여 수집되고 HPMC 분리를 위해 50ml 원추형 튜브로 옮겨집니다. PBS를 튜브에서 제거하고 HPMC를 37°C에서 PBS a 0.5 x g에서 펠렛화합니다.(MC, 중피...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS (PBS)	피셔 사이언티픽	SH3001304
외날 면도날	피셔 사이언티픽	12-640
15cm 배양 접시	BD 바이오사이언스	353025
소 태아 세럼(FBS)	생명 기술	16000044_3616914956
L-글루타민을 함유한 DMEM	코 닝	10-013-이력서
MEM 비타민	코 닝	25-020-CL
MEM 비필수 아미노산	코 닝	25-025-CI
페니실린-스트렙토마이신	코 닝	30-002-CI
셰이 커	써모 피셔	맥스Q 4450
원심 분리기	에펜도르프	5702
부 화기	써모 피셔	Forma 시리즈 II 워터 재킷 CO2 인큐베이터 Model 3100
T-75 플라스크	BD 바이오사이언스	353136
T-175 플라스크	BD 바이오사이언스	353112
피펫 팁	라이닌	P2, P10, P20, P200 및 P1000
현미경	자이스	액시오베르트 200m
안티-Integrin αVβ3 항체, clone LM609	EMD 밀리포어	MAB1976
베타 1	온코시너지	운영체제2966
알파 5 [CD49e]	ID 파밍겐	555615
베타 4 [CD104]	EMD 밀리포어	MAB 2058
피펫 팁	코 닝	필터링된 팁 P2, P10, P20, P200 및 P1000
유리 플라스크