Modeling Ovarian Cancer Cell Colonization of Omentum: An ex vivo method to establish Milky spot colonization of fluorescently labeled ovarian cancer cells in murine omentum explants(오멘텀의 난소암 세포 집락화 모델링: 쥐 오멘텀 외식에서 형광 표지된 난소암 세포의 밀키 스폿 집락화를 확립하기 위한 생체 외 방법)

초록

출처: Krishnan, V. et al. 복막 지방에서 은하수 반점 구조의 난소암 전이성 집락을 연구하기 위한 생체 내 및 생체 외 접근 방식. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오에서는 난소 이식 내 난소암 집락화를 연구하기 위해 GFP 발현 난소암 세포와 겹쳐진 생체 외 난소 장기 배양을 확립합니다. 이 프로토콜은 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spot)으로 알려진 망막 내의 면역 세포 구조를 분석합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 생체 외 밀키 스팟 집락

1. 기본적인 체외(ex vivo) 장기배양 조건 확립
   1. 각 오멘텀을 단일 배양 플레이트 삽입물에 넣고 20% FCS를 함유한 500μl의 DME/F12 배지가 포함된 12웰 조직 배양 플레이트의 한 웰 내에 배치합니다. 24-48시간 및/또는 추가 시점 동안 5% CO₂ 환경에서 37°C로 장기 배양을 유지합니다. 각 조건(예: 미디어 유형/시점)에 대해 세 개의 독립적인 오멘타(삼중 샘플)를 사용합니다.
   2. 실험 종말점에서 조직의 무결성을 확인하려면 1.1.3단계에 설명된 대로 샘플을 수정하고 처리합니다. H&E 절편에서 건강한 지방 세포와 괴사성 지방 세포를 계수하면 조직의 무결성을 평가할 수 있습니다. 존재하는 살아있는 조직의 비율을 공식화하기 위해 5개의 생물학적 샘플에서 최소 ~120개의 세포가 필요합니다.
   3. 조직 기능을 측정하려면 20% FCS가 포함된 500μl의 DME/F12 배지가 들어 있는 24웰 플레이트의 별도 웰에 오멘타(n=3)를 놓습니다. omenta가 24시간 동안 5% CO₂ 환경에서 37°C로 배지를 컨디셔닝한 다음 IL-6 ELISA 분석에 사용하기 위해 250μl를 제거합니다.
2. SKOV3ip.1-GFP 세포를 사용한 마우스 오멘텀의 생체 외 공동 배양
   1. T-75 플라스크에서 10ml의 배지에 1x10⁶ 해동된 세포를 피펫팅하여 형광 태그가 부착된 세포를 성장시키고 준비합니다. 세포가 37% confluence에 도달할 때까지 5% CO₂ 환경에서 70°C에서 성장하도록 합니다. 트립신화(Trypsinize)하고 ml당 2 x 10⁶ 세포의 농도로 재현탁합니다.
   2. ~6 μl의 조직 접착제를 배양 삽입물의 멤브레인에 바르고 자연 건조시킵니다. 과도한 접착제를 제거하기 위해 멸균수로 멤브레인을 두 번 세척하십시오. 층류 후드 아래에서 멤브레인을 자연 건조시킵니다.
   3. 오멘타를 조심스럽게 절제하고 멸균 집게를 사용하여 접착 코팅된 멤브레인에 부착합니다. 매체를 추가하기 전에 1분 동안 조직이 멤브레인에 부착되도록 합니다. 각 배양 삽입물의 각 오멘텀 위에 500μl의 세포 현탁액을 추가합니다. 트랜스웰 챔버 주변을 2.5ml의 DME/F-12로 채웁니다.
   4. 5% CO₂ 환경에서 37°C에서 6시간 동안 세포 현탁액으로 오멘타를 배양합니다. 조심스럽게 제거하고 ~10ml의 PBS로 오멘타를 씻으십시오. 적절한 형광 이미징 시스템을 사용하여 형광 암 세포 병소를 시각화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
해부 도구	정밀 과학 도구	해당 없음
가임사	플루카/시그마 알드리치	48900
포르말린 5%	시그마	HT501320
DMEM을 참조하십시오.	코 닝	10-013-이력서
PBS (PBS)	코 닝	21-040-이력서	칼슘과 마그네슘 없음
콜라겐 분해 효소	워 딩 턴	LS004196
밀리셀 배양 플레이트 인서트	밀리포어	PICM01250
셀탁	코 닝	제354240

년 조