고체 표본에서 원발성 난소암 세포 채취: 난소 종양 표본에서 상피 난소암 세포를 배양하는 방법

초록

출처: Pribyl, L. J. et al. 고형 표본에서 원발성 난소암 세포를 얻는 방법. J. Vis. 특급. (2014년)

이 비디오에서는 고형 난소 종양 조직 표본에서 원발성 난소암 세포를 분리하고 특성화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 상피암 세포는 난소암의 시작 및 발달로 이어질 수 있는 과정을 이해하는 데 적합합니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 제도적, 국가적, 국제적 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 조직 처리

1. 멸균 조건에서 작업하면서 10ml의 신선하고 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시(60mm x 60mm)에 샘플을 옮기고 멸균 면도날을 사용하여 가능한 가장 작은 조각(2mm 이하)으로 더 자릅니다(그림 1A 및 1B).
2. 다진 조직을 DMEM에서 10ml의 예열된(30분 동안 37°C) dispase II(2.4U/ml)가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브로 옮기고 5% CO₂ 및 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 표본의 최적 소화를 보장하려면 5분마다 세포 슬러리를 수동으로 교반하십시오.
3. 30분 배양 후 세포 슬러리를 50ml 원뿔형 튜브 위에 놓인 세포 스트레이너(70μm 메쉬)로 옮기고 주사기 플런저를 사용하여 메쉬에 부드러운 압력을 가합니다. 해리되지 않은 조직(메쉬 상단에 남아 있음)을 버리고 얻어진 세포 현탁액을 50ml 멸균 원뿔형 튜브에 수집합니다. 320 x g에서 4°C에서 7분간 원심분리기(그림 2).
4. 상등액을 버리고 10% FBS를 함유한 DMEM 10ml에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
5. 세포 현탁액을 5% CO₂ 및 37°C의 페트리 접시에서 배양합니다(그림 3).
6. 초기 도금으로부터 24시간 후에 매체를 교체하십시오. 이를 통해 세포 파편과 배양에 존재하는 대부분의 적혈구를 제거할 수 있습니다.
7. 다음 2주 동안 3일마다 배지를 교체한 후 1차 EOC의 배양이 다운스트림 응용 프로그램을 위해 준비됩니다.

결과

그림 1. 임상 표본 처리. A) 얼음처럼 차가운 신선한 1x PBS 10ml가 들어 있는 페트리 접시에 옮겨진 고체 표본. B) 약 2mm 크기의 조각으로 추가로 절단된 임상 표본

그림 2. 해리되지 않은 조직에서 EOC 세포 분리. 효소 분해 후, 임상 검체를 세포 여과기로 옮기고 주사기 플런저를 사용하여 분해된 임상 검체에 부드러운 압력을 가합니다. 이를 통해 결합 조직에서 EOC를 기계적으로 분리하...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PBS 1개, 멸균	인비트로젠	14190-144
나사 뚜껑, 폴리프로필렌 시편 컨테이너, 멸균	써모 사이언티픽(Thermo Scientific
DMEM 매체, 멸균	인비트로젠	11995-065
소 태아 혈청, 멸균	Thermo Scientific 하이클론	SH30396.03
100x 페니실린-스트렙토마이신, 액상	인비트로젠	15140-122
Dispase II, 멸균	로슈	제04942호 078호 001
작은 가는 끝 겸자와 메스 블레이드, 멸균	피셔 사이언티픽	겸자 : 08-953E, 블레이드 : 08-927-5일
작은 해부 가위, 멸균	피셔 사이언티픽	08-945
15ml 원뿔형 뚜껑이 있는 튜브, 멸균	BD 팔콘	352097
50ml 원뿔형 뚜껑이 있는 튜브, 멸균	BD 팔콘	352027
10 ml 혈청 피펫, 멸균	코 닝	13-678-11E
6ml 주사기 플런저, 멸균	타이코 헬스케어	8881516911
나일론 필터 (70 μm) 셀 스트레이너, 메 마른	BD 팔콘	352350
5cm 페트리 접시, 멸균	코 닝	430166
10cm 페트리 접시, 멸균	코 닝	430167