Mesothelial clearance Assay: 난소암 스페로이드가 중피 세포 단층으로 침투하는 능력을 정량화하는 In vitro 기술

초록

출처: Davidowitz, R. A. et al. 난소암 전이의 초기 단계를 모델링하는 체외 중피 제거 분석. J. Vis. 특급(2012년)

이 비디오는 형광 표지된 세포와 타임 랩스 비디오 현미경을 사용하여 난소암 스페로이드와 중피 세포의 상호 작용을 정량적으로 측정하는 기술에 대해 설명합니다. 이 in vitro assay는 in vivo에서 전이되는 난소암 세포 스페로이드와 복막강 내벽의 중피 세포 간의 상호 작용을 모델링합니다.

프로토콜

1. 난소암 세포 스페로이드 형성

1. RFP 발현 난소암 세포는 10% 염기 배지(199와 MCDB105의 50:50 혼합물, 10% 불활성화 소 태아 혈청 및 1% 펜 연쇄상구균을 포함하는 맞춤형 세포 배양 배지)에서 배양됩니다. 표지되지 않은 난소암 세포에서 RFP를 발현하려면 RFP를 함유한 플라스미드로 세포를 transfection하고 RFP를 발현하는 세포를 선택합니다. 또는 바이러스 벡터를 사용하여 형광 단백질을 일시적으로 발현하거나 적색 형광 세포 추적기 염료(Invitrogen)로 세포를 사전 배양할 수 있습니다.
2. 난소암 스페로이드를 형성하기 전에 저접착력 96웰 둥근 바닥 배양 접시를 준비해야 합니다. 저접착력 배양 플레이트를 생산하려면 96웰 세포 배양 접시의 각 웰에 30μL 폴리-HEMA(1ml 95% EtOH에 6mg 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트) 용액을 추가합니다. 96웰 플레이트는 37°C의 비가습 인큐베이터에서 배양되어 에탄올을 증발시키고 각 웰에 폴리-HEMA 필름을 남깁니다. 이 poly-HEMA 필름은 세포가 웰 바닥에 부착되는 것을 방지하여 세포가 현탁액으로 성장하도록 합니다. [또는 Ultra-Low Attachment Culture Plate(Corning)를 사용할 수 있습니다.]
3. 다음으로, 난소암 세포를 트립신화하고 세포를 탁상용 원심분리기(Heraeus)에서 900 RCF로 3분 동안 펠렛화합니다. 상등액을 흡입하고 10% 염기 배지에서 재현탁합니다.
4. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오.
5. 10% 염기 배지 50μL당 100개의 세포가 있도록 세포의 농도를 조정합니다.
6. 균일하게 부유된 희석된 세포 현탁액 50μL를 96웰 폴리-HEMA 코팅된 배양 접시의 각 웰에 추가합니다.
7. 96-well plate를 37°C cell culture incubator에서 16시간 동안 배양하여(이 시간은 특정 세포주가 다세포 스페로이드를 형성하는 데 걸리는 시간 또는 원하는 실험 조건에 따라 늘리거나 줄여야 함) 난소암 세포가 함께 뭉쳐 각 웰에 단일 다세포 스페로이드를 형성할 수 있도록 합니다. 일부 종양 세포는 이 기간 동안 세포사멸을 겪을 수 있으므로 세포사멸을 유도하기 전의 시간을 선택하는 것이 중요합니다.

2. 중피 세포 단층 형성

1. 세포 배양 후드에서 접시의 각 웰에 5μg 피브로넥틴/mL PBS 용액 2mL를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 6웰 유리 바닥 MatTek 접시의 웰을 피브로넥틴으로 사전 코팅합니다. MatTek 접시에 있는 유리 바닥의 광학 품질은 고해상도 현미경 이미징을 가능하게 합니다.
2. GFP 발현 중피 세포는 10% 염기 배지에서 배양됩니다. 중피 세포 플레이트를 트립신화하고, 900RPM으로 탁상용 원심분리기(Heraeus)에서 3분 동안 스핀다운한 다음, 상층액을 흡인하고, 10% 염기 배지에서 다시 현탁합니다. 여기에 사용된 중피 세포는 획득 시 이미 GFP를 발현하고 있었지만, 표지되지 않은 중피 세포는 GFP cDNA를 함유한 플라스미드로 transfection하거나 녹색 형광 세포 추적기 염료(Invitrogen)에서 세포를 사전 배양하여 생산할 수 있습니다.
3. 30분 피브로넥틴 배양 후(2.1단계에서) MatTek 접시의 웰을 2mL PBS로 세척합니다.
4. PBS를 흡인하고 6-well MatTek 접시의 각 웰에서 웰당 6 x10⁵ 중피 세포를 플레이트화합니다. MatTek 디쉬를 37°C 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양하여 중피 세포가 디쉬에 부착되어 단층을 형성할 수 있도록 합니다.

3. Mesothelial cell clearance assay

1. 피펫을 사용하여 96웰 폴리-HEMA 코팅 플레이트에서 난소암 스페로이드를 수집합니다.
2. 중피 세포 단층을 포함하는 6-well MatTek 접시의 한 웰에서 배지를 흡인합니다. 2mL PBS로 한 번 씻으십시오. 96웰 플레이트의 모든 스페로이드를 MatTek 접시의 한 웰에 추가합니다(이미지화할 수 없는 접시 부분에 떨어지는 스페로이드를 설명하기 위해 이미지화할 스페로이드 수의 ~3배).
3. MatTek 접시를 s에 놓습니다.tage 최소 8시간 동안 타임 랩스 이미징을 수행할 수 있는 반전 광시야 형광 현미경. 전동 스테이지를 사용하여 단일 실험에서 여러 스페로이드 삽입 이벤트와 함께 접시의 여러 위치를 이미지화할 수 있습니다. 우리는 Perfect Focus System이 통합되고 [20x-0.75 개구(NA)] 배율/NA 미분 간섭 대비(DIC) 광학 장치가 있는 Nikon Ti-E Inverted Motorized Widefield Fluorescence 저속 현미경, 0.52NA 장거리 작동 거리(LWD) 콘덴서가 있는 Nikon 할로겐 트랜스일루미네이터, Nikon 고속(<100밀리초 스위칭 시간) 여기 및 방출 필터(GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter 고속 투과 및 에피 형광 경로 스마트 셔터, Nikon 선형 인코딩 전동 스테이지, Hamamatsu ORCA-AG 냉각 CCD(전하 결합 장치) 카메라, 온도 및 CO₂ 제어 기능이 있는 맞춤형 현미경 배양 챔버, Nikon NIS-Elements AR 소프트웨어 버전 3 및 TMC 진동 차단 테이블.
4. 난소암 세포 타원체는 접시 바닥에 가라앉아 중피 세포 단층에 부착됩니다. 8시간 동안 10분마다 20+ 스페로이드/단층 상호 작용의 GFP, RFP 및 위상 이미지를 수집합니다.
5. RFP 발현 난소암 세포 스페로이드는 GFP 발현 중피 세포 단층으로 침입하여 단층에 구멍을 만듭니다. 8시간 후, Elements 소프트웨어(또는 이미지 J와 같은 다른 적절한 소프트웨어)를 사용하여 GFP 이미지의 블랙홀을 추적하여 구멍의 크기를 측정합니다. 8시간의 구멍 크기를 시간 0의 해당 RFP 이미지의 스페로이드 크기로 나누어 구멍 크기를 초기 스페로이드 크기로 정규화합니다. 이 예에서 구멍 크기는 한 번만 측정되었지만 삽입의 역학을 더 잘 이해하기 위해 8시간 실험 동안 여러 번 측정할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
OVCA433 난소암 세포			Dennis Slamon 박사의 선물
ZT 중피 세포			Tan Ince 박사의 선물
미디엄 199	GIBCO - 라이프 테크놀로지스	19950
MCDB105	셀 응용 프로그램 Inc.	117-500
FBS-열 비활성화	GIBCO, 생명 기술	10082
펜 스트렙	GIBCO, 생명 기술	15070
96웰 플레이트	코 닝	3799
폴리 하이드 록시 에틸 메타 크릴 레이트 (폴리 HEMA) 192066-25G	시그마-알드리치		폴리 HEMA 용액의 경우 6mg 폴리 HEMA 분말을 95 % EtOH 1ml에 용해시킵니다
이토(EtOH	팜코-AAPER	111ACS200	dH20에서 95%로 희석
세포 배양 후드	누에르	NU-425-300
조직 배양 인큐베이터	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific, Inc.)	3110
poly-HEMA 플레이트용 인큐베이터 305	Labline 기구	제국 III
탁상용 원심분리기	헤레우스 악기	01일75003429
6 웰 유리 바닥 접시	MatTek 공사	P06G-1.5-20-F
피브로넥틴	시그마-알드리치	F1141-1MG
PBS (PBS)	셀그로	21-040-이력서
현미경	Nikon 악기		Ti-E 퍼펙트 포커스 시스템이 통합된 도립 전동 형광 타임랩스 현미경
렌즈	Nikon 악기		20X-0.75 수치 apeture
할로겐 트랜스루미네이터	Nikon 악기		0.52NA 긴 작동 거리 콘덴서
여기 및 방출 필터	크로마 테크놀로지 코퍼레이션		GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFPmCherry Ex 575/50 Em 640/50
투과 및 Epifluoresce 광 경로	셔터 인스트루먼트 컴퍼니		스마트 셔터
선형 인코딩 전동 스테이지	Nikon 악기
냉각식 충전 결합 장치 카메라	하마마츠 제작소	오르카-AG
온도 및 CO2 제어 기능이 있는 현미경 배양 챔버			맞춤 제작
방진 테이블	티엠씨
NIS-Elements 소프트웨어	Nikon 악기		버전 3

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