암세포에 대한 최적의 억제성 종양 치료 자기장 빈도 결정: 암세포 생존력에 대한 TTFields의 효과를 평가하기 위한 비침습적 체외 방법

1. TTFields 체외 도포 시스템 - 베이스 플레이트 및 식기 유지 관리

1. 흐르는 수돗물로 접시와 접시 덮개를 헹굽니다. 그런 다음 탈이온수로 헹구고 얼굴을 아래로 하여 자연 건조시킵니다.
2. 이전 실험에서 화학 요법제/약물을 접시에 첨가한 경우 각 접시에 5% 가벼운 세제 용액을 채우고 밤새 그대로 두십시오.
   1. 접시 내부에 세제의 흔적이 남지 않도록 흐르는 수돗물로 접시를 철저히 헹굽니다. 접시와 접시 덮개를 탈이온수로 헹구고 앞면이 아래로 향하게 하여 자연 건조시킵니다.
3. 깨끗하고 마른 접시를 덮개와 함께 살균 백에 넣으십시오. 가방을 밀봉하고 접시가 아래를 향하도록 하여 오토클레이브에 넣습니다. 121°C 이하에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
4. 오토클레이브를 건조 프로그램으로 설정하고 오토클레이브 도어를 부분적으로 열고 30분 동안 접시를 건조시킵니다.
5. 70% 에탄올을 살짝 적신 천으로 베이스 플레이트를 닦습니다.

2. 실험 설정

참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 장비 및 재료는 재료 목록에 설명되어 있습니다. 아래의 모든 단계는 멸균 상태가 유지되는 동안 층류 캐비닛 내부에서 수행해야 합니다.

1. 섹션 1에 설명된 대로 깨끗하고 멸균된 TTFields 접시와 커버를 준비합니다. 70% 에탄올을 살짝 적신 천으로 베이스 플레이트를 닦습니다.
2. 덮개가 있는 TTFields 식기를 접시를 부드럽게 누르고 접시의 가장자리가 베이스 플레이트의 핀 3개에 잠길 때까지 시계 방향으로 약 5mm 돌려 베이스 플레이트에 설치합니다. 각 접시 바닥에 멸균 22mm 커버슬립(처리된 플라스틱 또는 유리)을 놓습니다.
3. 완전한 성장 배지(U-87 MG 및 F98에 대한 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지; A2780 및 OVCAR-3용 RPMI; 재료 목록에 설명된 대로 보충됨).
   참고: 세포 농도는 세포 유형과 실험 기간에 따라 다릅니다. 실험이 끝날 때까지 80%-90% 융합 세포 성장을 초과해서는 안 됩니다.
   주의: 인간 세포주는 생물학적 위험을 나타낼 수 있으므로 적절한 안전 조치로 처리해야 합니다.
4. 200μL의 세포 현탁액(배가 시간에 따라 72시간 실험의 경우 일반적으로 200μL에 5,000-20,000개의 세포)을 각 커버슬립의 중앙에 한 방울로 놓고 접시 뚜껑으로 덮습니다.
5. 세포가 부착될 때까지 CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 배양합니다. 이 단계에서 하룻밤 배양이 가능합니다.
6. 200 또는 1,000 μL 피펫을 사용하여 낙하에서 유체를 흡입합니다.
7. 각 접시를 채우기 위해 완전한 성장 배지 2mL를 부드럽게 피펫으로 분사합니다. 멸균 팁을 사용하여 피펫을 피펫하고 커버슬립 가장자리를 부드럽게 두드려 슬라이드 아래에 가끔 끼인 기포를 제거합니다.
8. 접시를 뚜껑으로 덮고 TTFields 처리가 시작될 때까지 37°C의 CO₂ 인큐베이터에 넣습니다.

3. TTFields 응용 프로그램

1. 부속된 TTFields 접시가 있는 베이스 플레이트를 냉장 CO₂ 인큐베이터로 옮깁니다.
   참고: 체외 TTFields 응용 프로그램은 열을 발생시킵니다. 따라서 접시의 온난화를 보상하기 위해 냉장 인큐베이터가 필요합니다. TTFields 강도가 높을수록 더 많은 열이 발생하며 더 낮은 인큐베이터 주변 온도가 필요합니다(표 1 참조). 임상적으로 유의미한 TTFields 농도는 TTFields 응용 분야의 인큐베이터 온도가 18-30 °C 범위일 때 달성됩니다.
2. 플랫 케이블 암 커넥터를 베이스 플레이트에 연결합니다. TTFields 생성기를 켭니다.
3. TTFields 체외 응용 프로그램 시스템 소프트웨어를 시작하고 실험 설정을 선택합니다.
   1. 새 실험을 정의합니다. 컴퓨터 화면의 소프트웨어 사용자 인터페이스에 실험 이름과 실험 소유자를 입력합니다. 각 접시 또는 베이스 플레이트의 빈도와 목표 온도를 조정합니다.
4. 소프트웨어를 사용하여 TTFields 응용 프로그램을 시작합니다.
5. 모든 접시가 제대로 연결되어 있고 모니터에서 연한 파란색으로 나타나는지 확인합니다. 접시에 빨간색 프레임이 동그라미로 표시되어 있으면(제대로 연결되지 않았음을 의미) 접시를 부드럽게 누르고 접점이 복원되고 접시가 연한 파란색으로 나타날 때까지 천천히 앞뒤로 돌립니다.
6. TTFields 체외 애플리케이션 시스템을 최대 24시간 동안 실행 상태로 둡니다.
7. 실험이 종점에 도달하면 소프트웨어에서 END EXPERIMENT 버튼을 클릭하여 실험을 중지하고 5단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 PAUSE 실험을 클릭하십시오.
8. 베이스 플레이트에서 플랫 케이블 커넥터를 분리합니다. 인큐베이터의 접시가 있는 베이스 플레이트를 층류 캐비닛으로 제거합니다.
9. 24시간마다 모든 접시의 매체를 교체하고 베이스 플레이트를 냉장 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 플랫 케이블을 사용하여 베이스 플레이트를 발전기에 연결합니다. CONTINUE 버튼을 클릭하여 실험을 계속합니다.

표 1. 인큐베이터 주변 온도 및 TTFields 접시 내부의 예상 TTFields 농도.

4. 컨트롤 샘플

참고: 대조 세포는 TTFields 응용 프로그램을 제외하고 TTFields 처리 세포와 유사한 조건에서 성장시킵니다.

1. TTFields 처리된 검체를 도금하는 데 사용되는 동일한 현탁액 및 유사한 표면에 있는 플레이트 대조군 검체.
2. 대조 접시를 37°C의 CO₂ 인큐베이터에 놓습니다.
3. TTFields 처리된 식기 배지 조건과 일치하도록 24시간마다 접시의 배지를 교체하십시오.

5. 실험 종료

1. END EXPERIMENT를 클릭한 후 소프트웨어가 시스템에서 모든 레코드를 검색하고 레코드를 컴퓨터에 저장할 때까지 기다립니다.
2. REPORTS 버튼을 사용하여 온도, 전류 및 저항 로그 다시view 각 베이스 플레이트의 파일을 사용하여 모든 접시가 실험 계획에 따라 처리되었는지 확인합니다.
   참고: 모든 보고서와 로그는 실험이 끝난 후 컴퓨터에 저장되며 언제든지 검토할 수 있습니다.
3. TTFields 생성기를 끕니다.
4. 베이스 플레이트에서 플랫 케이블을 분리하고 인큐베이터에서 제거합니다.
5. 세라믹 접시를 제거하려면 접시를 아래로 누르고 시계 반대 방향으로 돌려 베이스 플레이트에서 잠금을 해제합니다.
6. 접시를 층류 캐비닛에 넣고 커버 슬립을 무균 적으로 제거합니다. 추가 검사 및 평가를 위해 신선한 배지 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 멸균 페트리 접시로 옮깁니다.