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닭 난자 배아와 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 달걀 준비하기
- 계란을 받기 전에 제조업체의 지침에 따라 계란 부화기를 37.8°C(100°F), 습도 60-70%로 조립하고 평형을 이루십시오.
메모: 오염 위험을 최소화하기 위해 오토클레이브 물을 사용하여 습도를 제어할 수 있습니다.
- 인증된 실험실 등급 계란 공급업체로부터 수정된 로드 아일랜드 레드 닭고기 달걀을 받으면 종이 타월로 껍질 표면을 닦습니다. 살짝 적신 종이 타월을 사용하여 부착된 물질을 제거할 수 있습니다. 즉시 건조시킵니다.
메모: 43.3 °C 이하의 액체로 껍질을 적시면 난자에 박테리아가 유입될 수 있습니다. 계란을 씻거나 소독하기로 선택한 경우 액체의 온도는 43.3-48.9 °C 사이여야 합니다. 더 높은 온도는 계란을 끓일 수 있습니다. 소독제의 선택은 우려를 일으키는 미생물에 따라 이루어져야 합니다.
- 연필이나 마커를 사용하여 달걀의 날짜를 표시하십시오. 이는 개발 데이 0으로 간주됩니다.
- 난자를 난자 인큐베이터에 넣고 CAM 발달을 위해 교대로 최소 7일 동안 배양합니다. 자동 회전기를 사용하거나 알을 하루에 2-3회 180° 회전시킬 수 있습니다.
2. 달걀 열기
참고: 난자를 여는 것은 CAM이 완전히 발달했을 때 수행해야 합니다. 이것은 일반적으로 개발 7일차 또는 8일차에 있습니다.
- 70% 에탄올로 생물 안전 캐비닛을 소독하십시오. 마찬가지로, 계란 선반, 계란 캔들 러, 마커, 실리콘 카바이드 연삭 석재 및 원형 절단 휠이있는 무선 회전 도구, 18G 바늘, 1/4 인치 진공 튜브가있는 피펫 컨트롤러, 포장 테이프, 사무용 가위, 곡선 가위, Semken (또는 이와 유사한) 집게, 면봉 및 6 x 7cm 투명 필름 드레싱. 가능하면 멸균 도구, 일회용 도구 또는 오토클레이브 도구를 사용하십시오.
- 계란 회전기를 끕니다. 약 1-3개의 계란을 계란 선반의 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 어둠 속에서 달걀 캔들러를 달걀 껍질에 대고 공기 세포를 식별합니다. 에어 셀의 위치를 표시하십시오.
메모: 달걀 캔들러의 조명 강도는 달걀 내부를 시각화하는 데 매우 중요합니다. 공기 세포나 혈관 구조가 지속적으로 보기 어려운 경우 계란 캔들러 배터리를 교체해 보십시오.
- 달걀 캔들러를 껍질 위로 움직여 큰 혈관 네트워크를 찾으십시오. 필요한 경우 계란을 회전시킵니다. 이상적인 혈관 구조는 난자의 중간 근처에서 분기되는 것입니다. 마커를 사용하여 이식에 사용할 혈관 구조 위에 그립니다.
- 후드의 조명을 켭니다. 탄화규소 연삭 석재가 장착된 무선 회전 도구를 사용하여 공기 전지 중앙 바로 위에 쉘의 작은 구멍을 뚫습니다. 껍질의 대부분이 제거될 때까지 구멍을 뚫지만 흰색 내부 멤브레인은 손상되지 않았습니다.
메모: 혈관 구조를 표적으로 삼기 전에 공기 세포를 뚫으면 CAM과 혈관 조직이 아닌 공기 세포 위의 특정 난자 껍질의 두께를 결정할 수 있습니다. CAM 또는 혈관 구조가 파괴되면 난자를 착상에 사용할 수 없습니다.
- 공기 세포에 대해 했던 것처럼 혈관 창이 열리는 또 다른 작은 구멍을 뚫고 엽니다(2.4단계).
- 18g의 바늘을 사용하여 흰색 내막을 통해 공기 세포와 혈관 조직을 부드럽게 뚫습니다. 껍질을 관통할 수 없으면 조심스럽게 조금 더 뚫으십시오. 흰색, 내부 멤브레인(CAM은 아님)이 천공 영역 전체에 걸쳐 중단되었는지 확인합니다. 멤브레인 조각을 제거할 필요가 없습니다.
메모: 이 단계에서 CAM 또는 혈관 구조가 파괴되면 난자를 버리십시오. 뚫린 구멍에서 혈액이나 알부민이 누출되면 손상이 분명합니다.
- 후드 라이트를 끕니다. 계란 캔들러를 사용하여 공기 세포가 계란 끝에서 혈관 구조 위의 영역으로 이동했는지 확인합니다. 필요한 경우 피펫 컨트롤러에 삽입된 진공 튜브를 원래 에어 셀 위의 구멍 주위에 놓고 공기 셀을 이동시키기 위해 짧은 버스트로 부드럽게 흡입을 가합니다.
- 마커를 사용하여 air-CAM 경계 안쪽 약 0.5cm에서 에어 셀의 새 위치를 윤곽을 그립니다. 새 공기 셀 바로 위에 포장 테이프 조각을 부착합니다. 필요한 경우 표준 사무용 가위를 사용하여 테이프를 적절한 크기로 자릅니다.
메모: 테이프는 쉘을 통한 공기 흐름을 방해할 수 있으며 공기 셀을 완전히 덮는 데 필요한 것보다 크지 않아야 합니다.
- 계란을 인큐베이터에 다시 넣어 새 공기 세포가 위를 향하도록 하여 회전하지 않고 따뜻하게 합니다. 나머지 달걀을 열려면 2.2-2.9단계를 반복합니다.
메모: 여기에서 프로토콜이 일시 중지될 수 있습니다. CAM 개발의 질이 확실하지 않은 경우 나머지 알을 열기 전에 소수의 알을 2.16단계로 진행해야 합니다.
- 공기 세포가 재배치된 약 1-3개의 계란을 생물 안전 캐비닛의 계란 선반에 놓습니다.
메모: 개봉한 계란에 오염이 유입되지 않도록 주의해야 합니다. 따라서 항상 생물 안전 캐비닛 안의 계란을 열고 가능하면 멸균 도구와 장비를 사용하십시오.
- 원형 절단 휠이 장착된 무선 회전 도구를 사용하여 2.8단계에서 그린 공기 세포 경계 위로 작은 선을 자릅니다. CAM 또는 혈관 구조를 방해하지 않도록 실제 air-CAM 경계 안쪽으로 약 0.5cm 떨어져 있는지 확인하십시오. 껍질을 완전히 절단하되 CAM 또는 혈관 구조를 방해할 만큼 충분히 깊이 침투하지 않도록 주의하십시오.
- 구부러진 가위를 사용하여 나머지 공기 세포 주위를 잘라 껍질에 창을 만듭니다.
메모: 제거된 껍질에 혈액이나 막이 있으면 난자는 착상에 적합하지 않습니다. 높은 비율의 난자가 깨끗하게 열리지 않은 경우 더 나은 CAM 형성을 위해 나머지 난자를 열기 위해 최소 1일을 더 기다리는 것이 좋습니다. 나머지 알의 껍질을 뚫지 않은 경우 인큐베이터 내에서 알의 회전을 재개해야 합니다.
- 배아의 생존 능력을 확인합니다. 생존 가능한 배아는 광범위한 혈관 구조, 명확한 알부민, 배아 움직임 또는 눈에 보이는 심장 박동을 나타냅니다.
- Semken 집게를 사용하여 멸균 면봉에서 작은 면 조각을 당깁니다. CAM 표면을 부드럽게 닦아내어 껍질 먼지와 파편을 제거합니다.
메모: 파편 제거는 난자를 개봉한 당일에 수행해야 합니다.
- 껍질 입구를 6 x 7cm 투명 필름 드레싱 1/4 조각으로 덮습니다.
- 알을 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 계란이 열린 창이 위를 향하도록 단단히 고정되고 CAM이 투명 필름 드레싱에 닿지 않도록 합니다. 계란 선반 조각, 계란 회전기의 가장자리 또는 다른 적절한 물건을 사용하여 계속 굴러가는 계란을 지지하십시오.
- 나머지 모든 달걀을 열려면 2.10-2.16단계를 반복합니다.
메모: 난자 개봉은 착상과 같은 날에 완료할 필요가 없습니다. 최소 1일을 기다리면 껍질을 열어 생존력이 저하된 난자를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다.