Chicken Chorioallantoic Membrane-based Cancer Modeling: An An In Ovo Model to Study Cancer Cell Tumorigenesis and Metastasis(닭 융모막막기반 암 모델링: 암세포 종양 형성 및 전이를 연구하기 위한 In Ovo 모델)

초록

출처: Sharrow, A. C. et al. 닭 융모막 In Vivo 모델을 사용하여 부인과 및 비뇨기과 암을 연구합니다. J. Vis. 특급(2020년)

이 비디오에서는 암세포를 닭 융모막막에 이식하여 난자 모델을 생성하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 부인암의 진행을 연구하기 위해 난소암 세포를 성공적으로 생착시킵니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 이식을 위한 암세포 현탁액 준비(옵션 1)

참고: 이것은 이식 직전에 완료되어야 하며, 이상적으로는 7일에서 10일 사이에 이루어져야 합니다. 이식 날짜에 관한 추가 정보는 3단계 또는 4단계 시작 부분의 참고 사항을 참조하십시오. 이 접근법은 모든 세포주와 배양된 신장암 종양 분해물에 사용되었습니다.

1. 얼음 위에서 세포외 기질 용액을 해동합니다.
2. 기계적 및/또는 효소 분해를 사용하여 이식되는 세포 유형에 적합한 방법을 사용하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
3. 이식할 세포의 총 수를 이식에 적합한 배지에 재현탁합니다. 난자당 1-2 x 10⁶ 세포의 보형물이 일반적입니다.
   메모: 세포주의 이식에 사용되는 배지는 일반적으로 FBS 또는 혈청 치환을 포함하는 세포 배양에 사용되는 완전한 배지입니다. 종양 절단물의 이식은 일반적으로 동일한 암 유형의 세포주를 배양하는 데 사용되는 완전한 배지를 사용합니다. 그러나, 실험적으로 필요한 경우 배지 제형에 대한 조정이 이루어질 수 있습니다. 종양 발달 및 성장에 미치는 영향은 경험적으로 결정되어야 합니다.
4. 사용되는 세포에 적합한 원심분리기 속도와 시간을 사용하여 세포를 펠렛화합니다. 일반적인 속도는 250-300 x g이고 시간은 5-10분입니다.
5. 파이펫팅을 통해 펠릿화된 세포에서 상등액을 제거합니다. 플릭(flicking) 또는 피펫팅(pipetting)을 통해 잔류 배지에 있는 세포를 기계적으로 재현탁시킵니다. 얼음 위에 올려 식힙니다. 적절한 크기의 피펫을 사용하여 세포와 배지의 부피를 측정합니다.
6. 1-2 x 10⁶ 세포가 난자당 20-100 μL의 부피에 이식되고 최종 세포외 기질 농도가 2.7-4 mg/mL 단백질이 되도록 주입 부피를 계산합니다. 이 계산에 따라 배지, 원하는 성장 인자 또는 첨가제 및 세포 외 기질 용액을 추가합니다. 이식할 준비가 될 때까지 얼음에 넣어 두십시오.
   메모: 1.3단계 및 1.6단계의 계산을 위해 그룹의 모든 난자에 대해 적절한 부피를 보장하기 위해 최소 1/2의 난자 보형물의 추가 부피를 통합해야 합니다. 난소암 세포주(즉, SKOV3 및 ID8)의 이식을 위해 난자당 10개의⁶ 세포를 이식했습니다. 신세포암 세포주 RENCA의 이식을 위해 소화된 원발성 인간 신세포암, 전립선암 세포주(즉, CWR, C4-2 및 MyC-CaP) 및 방광암 세포주(즉, HT-1376 및 T24)에서 유래한 배양 세포, 2 x 10⁶ 세포를 이식했습니다.

2. 이식을 위한 종양 조각 준비(옵션 2)

참고: 이것은 이식 직전에 완료되어야 하며, 이상적으로는 7일에서 10일 사이에 이루어져야 합니다. 이식 날짜에 관한 추가 정보는 3단계 또는 4단계 시작 부분의 참고 사항을 참조하십시오. 원발성 난소암과 방광암은 종양 조각으로 이식되었습니다.

1. 얼음 위에서 세포외 기질 용액을 해동합니다. 원하는 성장 인자 또는 첨가제를 함유한 적절한 배지에서 최종 단백질 농도 2.7-4mg/mL로 희석합니다. 얼음에 보관하세요.
   메모: 종양 조각의 이식은 일반적으로 동일한 암 유형의 세포주를 배양하는 데 사용되는 완전한 배지를 사용합니다. 그러나, 실험적으로 필요한 경우 배지 제형에 대한 조정이 수행될 수 있습니다. 종양 생착 및 성장에 미치는 영향은 경험적으로 결정되어야 합니다.
2. 메스나 가위를 사용하여 신선한 종양 조각을 절제합니다. 이상적인 크기는 각 면이 2-5mm입니다. 이식할 준비가 될 때까지 조직을 배지에 담그십시오.

3. 붙지 않는 링을 사용한 이식 (옵션 1)

참고: CAM이 완전히 개발된 경우 개발 7일차부터 세포를 이식할 수 있습니다. 착상은 종양 발달과 원하는 실험을 위한 충분한 시간을 허용하는 부화 전 언제든지 발생할 수 있지만 배아의 면역 세포는 수정 후 10일경에 존재하기 시작합니다. 종양 성장 속도는 세포 유형에 따라 상당히 다르며 관심 세포 유형에 대해 경험적으로 결정해야 합니다. 난소암과 전립선암 세포는 붙지 않는 고리 방법을 사용하여 이식했습니다. 눌어붙지 않는 링을 사용할 수 없는 경우 피펫 팁을 비슷한 크기로 잘라 사용할 수 있습니다.

1. 70% 에탄올을 사용하여 생물 안전 캐비닛과 필요한 모든 도구(계란 선반, 곡선형 홍채 집게, 붙지 않는 링(내경 1/4인치), 유리 교반 막대, 적절한 용량의 피펫 및 팁, 6 x 7cm 투명 필름 드레싱, 사무용 가위, 마커 또는 연필. 가능하면 멸균 도구, 일회용 도구 또는 오토클레이브 도구를 사용해야 합니다.
2. 생물 안전 캐비닛의 난자 선반에 이식할 난자를 놓습니다. 관리 가능한 수의 계란을 선택하십시오. 일반적으로 최대 6개까지 가능합니다. 달걀로 작업하는 동안 달걀을 너무 식히지 마십시오.
3. 껍질 조각이 당겨지지 않도록 가장자리를 열린 창 쪽으로 굴려 껍질에서 투명 필름 드레싱을 제거합니다. 난자가 생존 가능하고 건강한지 확인하십시오. 이상적인 알은 열린 영역의 중앙에 큰 용기가 있고 더 작은 용기가 거기에서 분기됩니다.
4. 곡선형 홍채 집게를 사용하여 멸균 된 달라 붙지 않는 링을 혈관 위의 CAM에 배치하고 이상적으로는 분기 지점 위에 놓습니다. 멸균 유리 교반 막대를 사용하여 CAM을 부드럽게 마모시킵니다.
5. 1.6단계의 세포 현탁액을 논스틱 링의 중앙으로 피펫합니다. 또는 집게를 사용하여 2.2단계의 종양 조각을 붙지 않는 고리의 중앙에 놓고 2.1단계에서 생성된 20-50μL의 세포외 기질 용액으로 덮습니다.
6. 6 x 7cm 투명 필름 드레싱 1/4 조각으로 개구부를 밀봉합니다. 난자에 적절한 임플란트 명칭을 붙입니다.
   메모: 그룹 내의 난자에 번호를 매기면 종단 관찰이 용이합니다.
7. 알을 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 껍질의 입구가 똑바로 세워져 있고 계란이 고정되어 있는지 확인하십시오.
   메모: 난자는 윤작 없이 난자 부화기로 되돌릴 수 있습니다. 또는 CO₂가 비활성화된 37-38°C 세포 인큐베이터와 습도계를 사용하여 습도를 모니터링하여 50%-80%여야 하는 높은 임플란트 후 생존력을 얻을 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
010 테프론(PTFE) 화이트 55 듀로 쇼어 D O-링	O-링 스토어	테프010	세포 파종을 위한 붙지 않는 링. 1/4"ID x 3/8"OD x 1/16"CS 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE).
섬세한 작동 가위; 곡선; 날카롭고 날카로운; 30mm 블레이드 길이; 4-3/4 에. 전체 길이	로보즈 서지컬	RS6703	이는 예제로 제공됩니다. 유사한 곡선 가위도 작동합니다.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max 툴 키트	드레멜	8050-N/18	이 키트에는 필요한 모든 도구가 포함되어 있습니다.
수정 계란 (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade)	AA 랩 달걀 Inc.	해당 사항 없음	이 공급업체는 지역적으로만 배송하므로 현지 계란 공급업체를 식별해야 합니다.
Hovabator Genesis 1588 디럭스 에그 인큐베이터 콤보 키트	인큐베이터 창고	HB1588D-없음-1102-1588-1357	다른 난자 부화기를 사용할 수 있지만 신뢰성을 확인해야 합니다. 이식 후에는 CO2가 비활성화된 세포 배양기를 사용할 수도 있습니다.
인큐-브라이트 쿨 라이트 에그 캔들러	인큐베이터 창고	1102	다른 캔들러를 사용할 수 있지만, 이것은 우리가 테스트한 것들 중에서 선호됩니다. 이 캔들러는 앞서 언급한 인큐베이터 키트에 포함되어 있습니다.
마트리겔 멤브레인 매트릭스 HC; LDEV-프리	코 닝	354248	세포외 기질 용액
스코브3	증권 시세	HTB-77	인간 난소암 세포주.
고무 경찰관이 있는 교반 막대; 직경 5mm, 길이 6인치	유나이티드 사이언티픽 용품	그pl06	이는 예제로 제공됩니다. 유사한 유리 교반 막대도 잘 작동합니다.
시편 겸자	전자 현미경 과학	72914	이는 예제로 제공됩니다. 생물 발광 이미징을 위해 껍질을 제거하는 데 사용되는 집게는 길이가 약 12.8cm이고 팁 너비가 3mm입니다.

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