아가로스 스핀 다운 분석법: 조직학적 분석을 위해 오가노이드를 삽입하는 기법

1. 조직학을 위한 오가노이드 처리: 아가로스 스핀 다운 방법

참고: 이 프로토콜은 Vlachogiannis et al.의 이전 간행물에서 채택되었습니다. 모든 오가노이드 집단을 성공적으로 임베딩하기 위해 아가로스 임베딩과 관련된 단계를 추가했습니다.

1. 웰에서 기존 미디어를 제거합니다. 기저막 돔을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
2. 동일한 부피(1단계에서 제거한 배지의 부피와 동일)의 세포 회수 용액을 추가하고 4°C에서 60분 동안 배양합니다.
3. 피펫을 사용하여 기저막 돔을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 기저막 돔을 부수십시오. 해리된 돔 및 세포 회수 용액을 1.5mL 튜브에 수집합니다.
4. 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기.
5. 상층액(세포 회수 용액)을 제거합니다. 마지막 펠릿화 단계에서 오가노이드의 존재가 확인될 때까지 모든 상등액을 별도의 튜브에 보관하십시오.
6. 원하는 부피의 차가운 PBS(표 1)를 추가하고 펠릿을 기계적으로 방해하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
7. 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기.
8. 상층액(PBS)을 제거합니다.
9. 펠릿을 실온에서 60분 동안 4% PFA의 일치하는 부피(예: 24웰 플레이트 배양 조건의 펠릿 1개에 대해 500μL, 표 1)로 고정합니다.
10. 고정 후 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
11. 상등액(PFA)을 제거합니다.
12. PBS와 원심분리기의 일치하는 부피(예: 24웰 플레이트 배양 조건의 펠릿 1개에 대해 500μL)로 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 세척합니다.
13. 따뜻한 아가로스(PBS의 아가로스 2%)를 준비합니다.
    메모: 여기에서 동결 절편용 세포 펠릿은 200μL의 OCT 화합물에 직접 재현탁될 수 있습니다.
14. 세포 펠릿을 200μL의 아가로스(PBS에서 2%)에 재현탁합니다.
    1. 아가로스를 첨가한 직후, 1.5mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 1mL 튜브 벽에서 세포 펠릿을 부드럽게 분리합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 세포 펠릿이 1.5mL 튜브의 벽에서 물리적으로 분리되지 않으면 아가로스 포매 공정 중에 세포 펠릿의 전체 또는 일부가 손실될 위험이 있습니다.
15. PBS의 2% 아가로스가 완전히 응고될 때까지 기다립니다.
16. 1.5mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 1mL 튜브에서 응고된 아가로스 블록을 분리합니다.
17. 세포 펠렛이 들어 있는 분리된 아가로스 블록을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
18. 튜브에 70%의 EtOH를 채우고 조직 탈수 및 파라핀 포매를 위한 기존 프로토콜을 사용하여 추가로 진행합니다.

표 1: 하나의 돔에 필요한 파종량 밀도, 기저막 부피 및 중간 부피

그림 1: 성공적인 아가로스 임베딩을 위한 핵심 단계. 1.5mL 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 분리하는 공정.