출처: Lee, S. et al. 환자 전립선암 뼈 전이 표본 및 이종 이식편에서 파생된 3차원(3D) 오가노이드의 설정 및 분석. J. Vis. 특급 (2020년)
이 비디오에서는 아가로스에 3D 전립선암 오가노이드를 삽입하기 위한 스핀다운 분석을 수행합니다. 이러한 임베디드 오가노이드는 암 성장 및 발달을 연구하기 위한 추가 조직병리학적 분석에 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
아가로스 스핀 다운 분석법: 조직학적 분석을 위해 오가노이드를 삽입하는 기법
5.5K 조회수
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2023년 4월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 조직학을 위한 오가노이드 처리: 아가로스 스핀 다운 방법
참고: 이 프로토콜은 Vlachogiannis et al.의 이전 간행물에서 채택되었습니다. 모든 오가노이드 집단을 성공적으로 임베딩하기 위해 아가로스 임베딩과 관련된 단계를 추가했습니다.
- 웰에서 기존 미디어를 제거합니다. 기저막 돔을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
- 동일한 부피(1단계에서 제거한 배지의 부피와 동일)의 세포 회수 용액을 추가하고 4°C에서 60분 동안 배양합니다.
- 피펫을 사용하여 기저막 돔을 제거하고 피펫 팁을 사용하여 기저막 돔을 부수십시오. 해리된 돔 및 세포 회수 용액을 1.5mL 튜브에 수집합니다.
- 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기.
- 상층액(세포 회수 용액)을 제거합니다. 마지막 펠릿화 단계에서 오가노이드의 존재가 확인될 때까지 모든 상등액을 별도의 튜브에 보관하십시오.
- 원하는 부피의 차가운 PBS(표 1)를 추가하고 펠릿을 기계적으로 방해하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
- 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리기.
- 상층액(PBS)을 제거합니다.
- 펠릿을 실온에서 60분 동안 4% PFA의 일치하는 부피(예: 24웰 플레이트 배양 조건의 펠릿 1개에 대해 500μL, 표 1)로 고정합니다.
- 고정 후 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 상등액(PFA)을 제거합니다.
- PBS와 원심분리기의 일치하는 부피(예: 24웰 플레이트 배양 조건의 펠릿 1개에 대해 500μL)로 300 x g 및 4°C에서 5분 동안 세척합니다.
- 따뜻한 아가로스(PBS의 아가로스 2%)를 준비합니다.
메모: 여기에서 동결 절편용 세포 펠릿은 200μL의 OCT 화합물에 직접 재현탁될 수 있습니다. - 세포 펠릿을 200μL의 아가로스(PBS에서 2%)에 재현탁합니다.
- 아가로스를 첨가한 직후, 1.5mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 1mL 튜브 벽에서 세포 펠릿을 부드럽게 분리합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 세포 펠릿이 1.5mL 튜브의 벽에서 물리적으로 분리되지 않으면 아가로스 포매 공정 중에 세포 펠릿의 전체 또는 일부가 손실될 위험이 있습니다.
- PBS의 2% 아가로스가 완전히 응고될 때까지 기다립니다.
- 1.5mL 주사기에 부착된 25G 바늘을 사용하여 1mL 튜브에서 응고된 아가로스 블록을 분리합니다.
- 세포 펠렛이 들어 있는 분리된 아가로스 블록을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 튜브에 70%의 EtOH를 채우고 조직 탈수 및 파라핀 포매를 위한 기존 프로토콜을 사용하여 추가로 진행합니다.
표 1: 하나의 돔에 필요한 파종량 밀도, 기저막 부피 및 중간 부피
명 분 명 의 명 의 명| 문화 플레이트 | 파종 밀도 (세포) | 기저막 부피 (μL) | 중간(μL) |
| 48 웰 | 25,000-50,000 | 20 | 250 |
| 24 웰 | 50,000-250,000 | 40 | 500 |
| 6 웰 | 50,000-250,000 | 40 | 2,000 |
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결과
그림 1: 성공적인 아가로스 임베딩을 위한 핵심 단계. 1.5mL 튜브의 벽에서 세포 펠릿을 분리하는 공정.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 피펫맨 | 길슨 | F123602 | |
| 1mL 주사기 | BD 주사기 | 329654 | |
| 1.5 mL 튜브 | Spectrum Lab 제품 | 941-11326-ATP083 | |
| 25G 바늘 | BD PrecisionGlide 바늘 | 305122 | |
| 4% 파라포름알데히드(PFA) | 알파 에자르 | J61899 | |
| 70% 에탄올(EtOH) | 폭스바겐 | BDH1164-4LP | |
| 아가로스 | 론자 | 50000 | |
| 세포 배양 플레이트 - 24웰 | 코스타 | 3524 | |
| 세포 배양 플레이트 - 48웰 | 코스타 | 3548 | |
| 세포 배양 플레이트 - 6웰 | 코스타 | 3516 | |
| 세포 해리 솔루션, Accumax | 혁신적인 세포 기술, Inc. | 오전105 | |
| 세포 회수 솔루션 | 코 닝 | 354253 | |
| 셀 스크레이퍼 | 사르슈테트 | 83.18 | |
| 디PBS | 코닝/셀그로 | 21-031-이력서 | |
| 1 mL용 피펫 팁(파란색 팁) | 피셔브랜드 레디-팁 | 21-197-85 | |
| 작은 탁상용 원심분리기 | 써모피셔 사이언티픽 | 75002426 | |
| OCT 컴파운드 | 티슈텍 | 4583 | |
| 수조 | 피셔 사우스 캐롤라이나 | 2320 |
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