전립선 오가노이드 분석법(Prostate Organoid Assay): 전립선 상피 세포의 분화 능력을 연구하기 위한 매트릭스 겔 링 기반 생체 외 배양 기술

초록

출처: Crowell, P. D. et al. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 매트릭스 겔링 기반 배양 기술을 사용하여 분리된 마우스 전립선 상피 세포를 배양하는 방법을 보여줍니다. 이 접근법은 유전적 또는 약리학적 조작에 반응하여 3D 선상 구조를 형성하기 위한 전립선 상피 세포의 분화 능력에 대한 보완적인 정보를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

1. 분류된 전립선 상피 세포를 1차 마우스 오가노이드 배양으로 도금 — 타이밍: 2-3시간(폴리-HEMA 코팅 플레이트 준비 제외)

참고: 플레이트는 Poly-HEMA로 코팅되어 매트릭스 겔 아래의 웰 표면에서 2D 콜로니 형성을 방지합니다. 분류된 기저 또는 내강 전립선 상피 세포를 마우스 오가노이드 배양으로 도금하기 1일 전에 Poly-HEMA 코팅 플레이트를 준비합니다. 감소된 성장 인자 매트릭스 겔(이하 매트릭스 겔이라고 함)의 분취액 1mL를 1.1단계 2시간 전에 얼음 위에서 해동합니다. Y-27632(ROCK 억제제)는 1.1단계 직전에 마우스 오가노이드 배지에 첨가해야 합니다. 얼음 위에서 1.1-1.8단계를 수행합니다.

1. 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 5mL 둥근 바닥 튜브에 세포를 펠렛화하고 상층액을 흡입합니다.
2. 세포 펠릿을 500μL의 마우스 오가노이드 배지로 세척합니다(표 1).
3. 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 상층액을 흡입합니다.
4. 마우스 오가노이드 배지에서 1,000 cells/μL의 세포 밀도로 재현탁합니다.
5. 마스터 믹스를 준비하려면 마우스 오가노이드 배지에 부유하는 상피 세포를 매트릭스 겔과 혼합하여 25%의 세포/배지와 75%의 매트릭스 겔을 포함하는 최종 혼합물을 생성합니다. 기저 세포는 일반적으로 100-2,000 cells/80 μL의 농도로 도금되는 반면, luminal cell은 일반적으로 2,000-10,000 cells/80 μL의 농도로 도금됩니다. 도금된 셀의 밀도는 예상되는 물질 수집 날짜와 원하는 다운스트림 응용 분야에 따라 다릅니다.
   알림: 마스터 믹스 준비 5분 전에 예상되는 마스터 믹스 용량에 적합한 크기의 튜브를 냉각합니다. 매트릭스 겔이 취급 중에 굳어지지 않도록 하려면 새 튜브로 옮기기 전에 매트릭스 겔을 3-4회 피펫팅하여 피펫 팁을 식히는 것이 중요합니다.
6. 24웰 플레이트의 웰당 80μL의 매트릭스 겔/세포 혼합물을 추가합니다. Poly-HEMA 코팅과의 직접적인 접촉을 피하면서 우물 벽의 아래쪽 절반에 물방울을 피펫팅하는 것이 좋습니다. 매트릭스 겔을 첨가한 후 플레이트를 소용돌이쳐 매트릭스 겔/세포 혼합물이 웰 가장자리 주위에 고리를 형성할 수 있도록 합니다.
7. 24웰 플레이트를 37°C 5% CO₂ 인큐베이터에 10분 동안 오른쪽으로 향하게 놓고 매트릭스 겔이 부분적으로 경화되도록 합니다.
   알림: 24웰 플레이트를 인큐베이터에 넣은 직후 37°C에서 마우스 오가노이드 매체를 가열하기 시작합니다.
8. 10분 동안 배양한 후 24웰 플레이트를 거꾸로 뒤집고 매트릭스 겔이 완전히 굳을 때까지 50분 더 배양합니다.
9. 350μL의 예열된 마우스 오가노이드 배지를 각 웰의 중앙에 적< 추가합니다> 참고: 매트릭스 겔의 무결성을 유지하려면 매체를 추가하는 동안 매트릭스 겔 링을 피하는 것이 중요합니다.
10. 배지를 추가한 후 24웰 플레이트를 37°C 5% CO₂ 인큐베이터에 다시 넣습니다.

2. 마우스 오가노이드 배지 보충 — 타이밍: 24웰 플레이트당 10-15분

참고: 기존 미디어는 48시간마다 새 미디어로 교체해야 합니다. 각 배지를 교체하기 전에 마우스 오가노이드 배지를 미리 예열합니다. 보충에 사용되는 배지에 ROCK 억제제를 추가할 필요는 없습니다.

1. 24웰 플레이트를 45° 각도로 기울이고 매트릭스 겔 링을 피하면서 P1000 피펫을 사용하여 각 웰 중앙에서 기존 매체를 부드럽게 제거합니다.
2. 1.9단계와 같이 350μL의 예열된 마우스 오가노이드 배지를 추가합니다. 주요 영양소 및 성장 인자의 급격한 고갈을 방지하기 위해 5일 이상 배양된 오가노이드에 더 많은 양의 배지(최대 1mL)를 추가하는 것이 좋습니다.

표 1: 마우스 오가노이드 배지 준비 지침

표시기

구성 요소	농도
나-27	1x (50x 농축액에서 희석)
글루타맥스	1x (100x 농축액에서 희석)
N-아세틸-L-시스테인	1.25 밀리미터.
노르모신	50 μg/mL
재조합 인간 EGF, 동물 무함유	50 ng / mL
재조합 인간 Noggin	100 ng / mL
R-spondin 1 컨디셔닝 미디어	10% 컨디셔닝 배지
대답83-01	200nM
증권 시세	1nM
Y-27632 이염산염 (ROCK 억제제)	10 μM
고급 DMEM/F-12	기본 미디어
R-spondin 1-조건화 배지는 Drost et al.에 설명된 대로 생성됩니다. 모든 구성 요소를 추가한 후 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 마우스 오가노이드 매체를 멸균합니다. ROCK 억제제는 오가노이드의 배양 및 전달이 이루어지는 동안에만 첨가됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
소 태아 세럼(FBS)	시그마	F8667
B-27 보충제 (50개), 무혈청	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17504044
고급 DMEM/F-12	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12634010
μ-접시 35mm, 높이	이비디	81156
Matrigel GFR 멤브레인 매트릭스	코 닝	CB-40230C
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15-140-122
폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트) (Poly-HEMA)	시그마	P3932-25G
Y-27632 이염산염 (ROCK 억제제)	Selleck 화학	S1049-50MG
대답83-01	토크리스	2939
(DiHydro) 테스토스테론 (5αAndrostan-17β-ol-3-one)	시그마	A-8380
글루타맥스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	35050061
노르모신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	개미-NR-1
재조합 인간 EGF, 동물 무함유	페프로텍	AF-100-15
재조합 인간 Noggin	페프로텍	120-10씨
RPMI 1640 중간, HEPES(10의 cs)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	22400105
Halt Phosphatase 억제제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	78428
완전한 프로테아제 억제제 칵테일	시그마	11836145001
트리톤 X-100	시그마	X100-5ML
음파 디스멤브레이터	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	FB120 (영어

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