단백질 용해물 추출: 세포 단백질을 수집하기 위해 오가노이드를 용해하는 기술

초록

출처: Crowell, P. D. et al. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오에서는 기저막 매트릭스 고리에서 배양된 전립선 오가노이드에서 단백질 용해물을 추출하는 방법을 보여줍니다. 추출된 단백질 분획을 분석하면 오가노이드의 계통 마커 발현을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 웨스턴 블롯 분석을 위해 전립선 오가노이드에서 단백질 용해물 추출 — 타이밍: 2.5-4

시간

참고: 단백질 용해물 추출을 위해 오가노이드를 수집하기 전에 디스파제 함유 배지를 준비하고 예열합니다(표 1).

1. 24웰 플레이트를 45° 각도로 기울이고 매트릭스 겔 링을 피하면서 P1000 피펫을 사용하여 각 웰 중앙에서 기존 배지를 부드럽게 제거하여 각 웰에서 배지를 제거합니다.
2. 오가노이드를 수집하려면 전체 링이 제거될 때까지 1mL의 디스파제 함유 배지를 매트릭스 겔 링에 직접 피펫팅하여 매트릭스 겔을 반복적으로 블라스팅하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   알림: Poly-HEMA 코팅된 웰과의 직접적인 접촉을 피하는 것이 중요합니다. 직접 접촉하면 수집된 물질이 Poly-HEMA로 오염되어 세포 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
3. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 37°C 5% CO₂ 인큐베이터에 30분에서 1시간 동안 넣어 디스파제로 매트릭스 겔을 완전히 분해합니다.
4. 실온에서 5분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛으로 내리고 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
5. 오가노이드 펠릿에 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하고 부드럽게 튕겨 재현탁합니다.
   참고: 오가노이드 펠릿을 충분히 재현탁하지 않으면 오가노이드 물질이 잔류 디스페이아제 또는 매트릭스 겔로 오염될 수 있습니다.
6. 800 x g에서 RT에서 5분 동안 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거합니다.
7. 드라이아이스와 메탄올이 들어있는 용액에 각 튜브를 넣어 오가노이드 펠릿을 빠르게 동결합니다. 나중에 -80 °C에서 사용할 때까지 튜브를 보관하십시오. 또는 1.6 단계에 따라 단백질 용해물을 즉시 추출하십시오.
8. 패킹된 세포 부피 10μL당 100μL의 단백질 용해 완충액(표 1)에 오가노이드 펠릿을 재현탁합니다. 다시 활성화하려면 튕깁니다.
   참고: 급속 냉동 후 다시 시작하는 경우, 포스파타제 및 단백질 분해 효소 활성을 방지하기 위해 즉시 샘플에 용해 버퍼를 추가해야 하므로 -80°C에서 샘플을 제거하기 전에 단백질 용해 버퍼를 해동해야 합니다.
9. 얼음 위에서 단백질 용해 완충액의 샘플을 최소 45분 동안 배양합니다.
   참고 : 핵 단백질 회수의 효율성을 높이기 위해 얼음에서 배양하기 전에 초음파 처리하는 것이 좋습니다. 그러나 초음파 처리는 필요하지 않습니다. 초음파 처리가 수행되지 않으면 1.10단계로 진행합니다.
   1. 초음파 처리하려면 튜브를 젖은 얼음에 담그고 음파 차단 장치의 끝을 마이크로 원심분리기 튜브에 부드럽게 적용합니다. 20kHz에서 40초 동안 초음파 처리합니다.
10. 확립된 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯으로 진행합니다.

표 1: 주요 솔루션 준비를 위한 지침

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레시피
디스파제 함유 매체	고급 DMEM F12의 1 mg/mL dispase + 10 μM ROCK 억제제. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
해리 미디어	RPMI 1640에서 10% FBS + 1x 페니실린-스트렙토마이신. 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 멸균합니다.
단백질 용해 완충액	RIPA 완충액 + 인산가수분해효소 억제제 + 프로테아제 억제제
차단 솔루션	PBS의 10% FBS(0.2% 트리톤 X-100

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
대답83-01	토크리스	2939
고급 DMEM/F-12	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12634010
B-27 보충제 (50개), 무혈청	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	17504044
Dispase II, 파우더	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 17-105-041
소 태아 세럼(FBS)	시그마	F8667
글루타맥스 써모(GlutaMAX Thermo	피셔 사이언티픽	35050061
Halt Phosphatase 억제제	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	78428
Matrigel GFR 멤브레인 매트릭스	코닝 CB-	40230씨
N-아세틸-L-시스테인	시그마	A9165
노르모신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	개미-NR-1
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15-140-122
폴리 (2- 하이드 록시 에틸 메타 크릴 레이트) (폴리-HEMA)	시그마	P3932-25G
방사성 면역침전 분석 (리파)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	PI89901
재조합 인간 EGF, 애니멀프리	페프로텍	AF-100-15
재조합 인간 Noggin	페프로텍	120-10씨
RPMI 1640 매체, HEPES (cs of 10)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	22400105
음파 디스멤브레이터	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	FB120 (영어
트리톤 X-100	시그마	X100-5ML
Y-27632 이염산염 (ROCK 억제제)	Selleck 화학	S1049-50MG

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