전체 마운트 면역형광 이미징: 온전한 오가노이드를 평가하기 위한 고정 및 염색 기법

초록

출처: Crowell, P. D. et al. Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture. J. Vis. 특급 (2019)

이 동영상은 온전한 전립선암 오가노이드의 면역형광 염색 기술과 전체 마운트 컨포칼 현미경에 의한 이미징에 대해 설명합니다. 이 기술은 기저 및 내강 전립선 상피 세포의 생체 외 분화 능력을 평가하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

1. 전산 공초점 현미경에 의한 면역조직화학 분석을 위한 전립선 오가노이드 고정 및 염색

1. 24웰 플레이트에서 전립선 오가노이드 수집 — 타이밍: 45-60분
   참고: 컨포칼 현미경 검사를 위해 처리하기 위해 전립선 오가노이드를 수집할 때 구조를 유지하기 위해 조심스럽게 취급하는 것이 중요합니다. 아래의 채취 프로토콜은 분리 중 오가노이드 구조의 중단을 줄이기 위해 고안되었습니다.
   1. 플레이트를 45° 각도로 기울여 오가노이드가 포함된 플레이트의 각 웰에서 매체를 제거합니다.
   2. 매트릭스 겔을 37°C 5% CO₂ 인큐베이터에서 30분 동안 500μL의 디스파제 함유 배지(표 1)로 배양하여 분해합니다.
   3. 미세 원심분리기 튜브에서 분해된 오가노이드 현탁액을 수집하고 RT에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화합니다.상등액을 제거합니다.
2. 전립선 오가노이드의 전체 마운트 면역 형광 염색 — 타이밍: 3-4일(1-5시간/일)
   1. PBS에 500μL의 4% 파라포름알데히드를 첨가하고 부드럽게 흔들면서 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
   2. RT에서 3분 동안 800 x g의 원심분리로 오가노이드를 펠렛화하고, 상층액을 제거한 후 1mL의 PBS로 펠렛을 부드럽게 흔들어 15분 동안 세척합니다.
   3. 1.2.2단계와 같이 펠릿을 두 번 더 세척합니다.
   4. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 차단 용액에 1μg/mL DAPI를 추가합니다(표 1). 상온에서 2시간 동안 배양하거나 4°C에서 하룻밤 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
   5. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 차단 용액에 1차 항체(rabbit anti-p63, mouse anti-cytokeratin 8)를 추가하고 4°C에서 부드럽게 흔들어 밤새 배양합니다.
   6. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. PBS 1mL로 펠릿을 부드럽게 흔들어 15분 동안 세척합니다.
   7. 1.2.6단계와 같이 펠릿을 두 번 더 세척합니다.
   8. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다. 차단 용액에 2차 항체(염소 항토끼 IgG-Alexa Fluor 594, 염소 항-마우스 IgG-Alexa Fluor 488)를 추가하고 4°C에서 부드럽게 흔들어 밤새 배양합니다.
   9. RT에서 3분 동안 800 x g의 원심분리로 오가노이드를 펠렛화하고, 상층액을 제거한 후 1mL의 PBS로 펠렛을 부드럽게 흔들어 15분 동안 세척합니다.
   10. 1.2.9단계와 같이 펠릿을 두 번 더 세척합니다.

2. 전체 마운트 컨포칼 현미경을 위한 염색된 전립선 오가노이드의 조직 제거 및 장착 — 타이밍: 7

시간

1. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다.
2. PBS에 30% 수크로스 1mL를 1% Triton X-100과 함께 넣고 부드럽게 흔들면서 상온에서 2시간 동안 배양합니다.
3. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다.
4. PBS에 45% 수크로스 1mL를 1% Triton X-100과 함께 넣고 부드럽게 흔들면서 상온에서 2시간 동안 배양합니다.
5. 실온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액을 제거합니다.
6. PBS에 60% 수크로스 1mL를 1% Triton X-100과 함께 넣고 부드럽게 흔들면서 상온에서 2시간 동안 배양합니다.
7. 상온에서 3분 동안 800 x g에서 원심분리하여 오가노이드를 펠렛화하고 상층액의 95%를 제거합니다.
   참고: 펠릿은 자당의 농도가 높아짐에 따라 느슨해집니다. 자외선 아래에서 DAPI로 염색된 오가노이드를 관찰하여 상등액을 제거하는 동안 손실되지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다.
8. 나머지 현탁액의 10-20 μL 액적을 챔버 커버슬립으로 옮기고 컨포칼 현미경 검사를 진행합니다.
   참고: 커버슬립 단편은 스페이서로 사용할 액적의 양쪽에 배치할 수 있습니다(그림 1C). 이는 커버슬립이 액적 위에 놓일 때 오가노이드가 무너지는 것을 방지합니다.

표 1: 주요 솔루션 준비를 위한 지침

표시기

구성 요소	농도
나-27	1x (50x 농축액에서 희석)
글루타맥스	1x (100x 농축액에서 희석)
N-아세틸-L-시스테인	1.25 밀리미터.
노르모신	50 μg/mL
재조합 인간 EGF, 동물 무함유	50 ng / mL
재조합 인간 Noggin	100 ng / mL
R-spondin 1 컨디셔닝 미디어	10% 컨디셔닝 배지
대답83-01	200nM
증권 시세	1nM
Y-27632 이염산염 (ROCK 억제제)	10 μM
고급 DMEM/F-12	기본 미디어
R-spondin 1-조건화 매체는 Drost 등에 설명된 대로 생성됩니다. 모든 구성 요소를 추가한 후 필터는 0.22μm 필터를 사용하여 마우스 오가노이드 매체를 멸균합니다. ROCK 억제제는 오가노이드의 배양 및 전달이 이루어지는 동안에만 첨가됩니다.

결과

그림 1: 웨스턴 블롯 및 전체 마운트 컨포칼 현미경에 의한 전립선 오가노이드의 계통 마커 발현 분석.(A) 배양 7일 후 기저 유래(위) 및 루미널 유래(아래) 오가노이드의 대표적인 위상차 이미지. 스케일 바 = 100μm. (B) 배양 5일 후 기저 유래(Bas) 및 발광 유래(Lum) 오가노이드의 웨스턴 블롯 분석. 기저 마커인 사이토케라틴 5(K5), 내강 마커인 사이토케라틴 8(K8) 및 로딩 컨트롤인 히스톤 H3(HH3)에 대한 염색. (C) 스페이서가 있는 챔버 커버슬립을 보여주는 개략도. (D) 배양 7일 후 기저 유래(위) 및 내강 유래(아래) 오가노이드의 대표적인 미분 간섭 대비(D...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
파라포름알데히드 16%	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	전화: 50-980-487
4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	D1306 (영어
고급 DMEM/F-12	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	12634010
Dispase II, 파우더	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 17-105-041
소 태아 세럼(FBS)	시그마	F8667
염소 안티 마우스 IgG-Alexa Fluor 488	인비트로젠	A28175
염소 안티 토끼 IgG-Alexa Fluor 594	인비트로젠	A11012
마우스 항 사이토케라틴 8	바이오레전드	904804
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15-140-122
토끼 안티 p63	바이오레전드	619002
RPMI 1640 중간, HEPES(10의 cs)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	22400105
자당	시그마	S0389-500G
트리톤 X-100	시그마	X100-5ML