기능성 와이어 기반 표적 세포 분리: 스파이크된 말초 혈액에서 암세포를 분리하는 생체 외 기술

참고: 이 프로토콜은 PBS 또는 HT-29 세포와 말초 혈액의 인공 혼합물에서 HT-29 세포(인간 대장암 세포주)를 분리하는 방법을 설명합니다. 동일한 실험을 두 개의 추가 세포주(LNCaP 및 VCaP)로 수행했으며 이론적으로 EpCAM을 발현하는 모든 세포에 대해 수행할 수 있습니다.

1. 타겟 셀의 준비

1. 세포 배양 및 세포 라벨링
   메모: 이 프로토콜에서는 세포를 75cm² 배양 플라스크에서 배양합니다. 다른 세포 배양 장치(예: 25cm² 배양 접시, 6웰 플레이트 등)를 사용하는 경우 그에 따라 시약의 양을 조정하십시오. 사용되는 모든 액체는 수조에서 37°C로 예열됩니다. 달리 표시되지 않는 경우 모든 프로토콜 단계는 실온(RT)에서 수행됩니다.
   1. 2mM L-글루타민, 20mM 헤페, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 McCoy의 5a 변형 배지에서 HT-29 세포를 5% CO₂ 분위기에서 37°C로 배양합니다.
   2. 세포가 90% 집중되면 배지를 제거하고 10mL의 1x PBS로 세포를 헹굽니다.
   3. 세포를 수확하려면 세포 분리 용액(재료 및 시약 표) 2mL를 세포에 추가하고 37°C에서 약 5분 동안 세포를 배양합니다.
      메모: 분리 용액에는 1x PBS, 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 3mg/L 페놀 레드의 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소가 포함되어 있습니다. 세포 분리 용액의 사전 예열 시간은 37°C에서 1시간 후에 비활성화되므로 최소로 줄입니다. 최적의 세포 분리를 얻기 위해 전체 세포층을 덮습니다.
   4. 도립 현미경을 사용하여 세포의 분리를 확인합니다.
   5. 분리된 모든 세포를 10mL의 세포 배양 배지가 미리 채워진 50mL 튜브(1.1.1단계에서 사용한 것과 동일)로 옮기고 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다.
   6. 나머지 셀 현탁액을 RT의 수평 롤러 믹서에 놓고 라벨링 단계를 진행합니다.
2. 타겟 세포의 살아있는 세포 라벨링
   1. 37°C에서 예열된 1x PBS 1mL에 5mM CFSE(디메틸 설폭사이드, DMSO로 제공) 1μL를 희석하여 즉시 사용 가능한 5μM CFSE 라벨링 솔루션을 얻습니다.
      메모: 최적의 염색 결과를 얻으려면 새로 준비된 용액을 사용하십시오.
   2. 1x PBS에 바로 사용할 수 있는 DNA 염색 용액(재료 및 시약 표)을 준비하고 빛으로부터 보호된 2-6°C에서 보관합니다.
      메모: 최적의 염색 결과를 얻으려면 새로 준비된 용액을 사용하십시오.
   3. 수평 롤러 믹서(step 1.1.6.)에서 세포를 추출하고 300 x g에서 10분 동안 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 1x PBS 10mL에 세포를 재현탁합니다.
   4. 1x PBS로 세포를 다시 헹구고 세포 펠릿을 즉시 사용 가능한 500μL CFSE 라벨링 용액에 재현탁합니다.
   5. 37°C에서 15분 동안 세포를 배양하고 300 x g에서 3분 동안 원심분리 후 세포를 수집합니다.
   6. 예열된 세포 배양 배지 1mL에 라벨링된 세포를 재현탁하고 세포가 37°C에서 30분 동안 재생되도록 합니다.
   7. 300 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 세포 펠릿을 37°C에서 10분 동안 즉시 사용할 수 있는 DNA 염색 용액 1mL에 재현탁합니다.
   8. 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거한 다음 1x PBS 4mL에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포 밀도를 평가하고 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 및 fluorescein isothiocyanate(FITC) 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 형광 표지를 확인합니다(그림 1A 및 1E).
   9. 300 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리하고 다음 섹션과 같이 각 실험에 필요한 세포 밀도에 따라 세포 펠렛을 재현탁하고 얼음 위에 놓습니다.

2. 전선 충전

참고: 세포는 표적 세포/말초 혈액 스파이크에서 밀리리터 규모로 분리하거나 마이크로리터 규모에서 적은 수의 세포를 제공함으로써 분리할 수 있습니다. 전자의 접근 방식은 말초 혈액의 희귀 세포 상태를 모방할 수 있는 반면, 후자는 프로토콜 최적화/테스트를 위해 몇 개의 세포를 부착하는 데 선호되는 방법일 수 있습니다.

1. 많은 양의 셀 서스펜션을 사용하여 전선 충전
   1. 1x PBS 40mL에 BSA 0.8g을 용해하여 2% BSA 차단 용액을 준비합니다(세포 배양 사용). 초기 와류를 통해 BSA를 용해시키고 이후 수평 롤러 믹서에서 RT에서 10-20분 동안 배양합니다.
   2. 빈 EDTA 튜브/헤파린 나트륨 튜브를 2% BSA 2mL로 헹구어 항응고제 잔류물을 제거하고 용액을 버립니다. 수평 롤러 믹서에서 15rpm으로 30분 동안 2% BSA 5mL를 사용하여 RT에서 배양하여 튜브 표면을 막고 용액을 폐기합니다.
   3. 라벨링된 세포(섹션 1.2.)를 100,000 cells/mL의 밀도로 희석하고 5mL를 사용하여 와이어를 충전합니다.
   4. 라벨링된 세포 현탁액 5mL(총 500,000개 세포)를 튜브에 추가합니다. 세포 현탁액을 추가할 때 기포를 피하십시오.
   5. 보관함에서 전선과 전선을 고정하는 고무 캡을 분리하고 1x PBS로 헹굽니다(그림 2).
   6. 주사기 바늘(20G)을 사용하여 EDTA 튜브의 고무 튜브 캡(단계 2.1.4)을 관통하고 캡이 튜브에 다시 연결되고 튜브가 기울어진 롤러 믹서에 놓일 때 기능 부품이 셀 서스펜션에 완전히 잠기도록 와이어를 삽입합니다.
      메모: 와이어의 3중 나선 기능 부분은 충전 전반에 걸쳐 셀 서스펜션으로 덮여 있어야 합니다.
   7. 기울어진 롤러 믹서의 튜브를 5rpm에서 30분 동안 회전하여 셀이 와이어에 부착될 수 있도록 합니다.
   8. 와이어를 5mL 1x PBS로 헹구고 육안 검사 때까지 1x PBS가 포함된 15mL 튜브에 2-6°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
      메모: 와이어의 기능 부분은 세포에 해를 끼치지 않도록 항상 PBS에 담가야 합니다.
2. 말초 혈액과의 인위적인 혼합물로부터 표적 세포를 분리(대체 충전 방법: 2.1. 많은 양의 셀 서스펜션을 사용하여 와이어 충전)
   1. 표지된 세포를 희석하여(섹션 1.2.) 높은 세포 밀도(> 1,000,000 cells/mL)를 가진 세포 현탁액을 얻어 말초 혈액에 추가된 세포 현탁액의 부피를 낮게 유지합니다.
   2. 500-500,000개의 세포를 5mL의 말초 혈액에 추가하고 튜브를 거꾸로 하여 혼합합니다.
   3. 보관함에서 와이어를 제거하고 와이어를 고정하고 있는 고무 캡을 제거한 다음 1x PBS로 헹굽니다.
   캡을 튜브에
   4. 다시 끼우고 튜브를 기울어진 롤러 믹서에 놓았을 때 기능 부분이 스파이크된 혈액에 완전히 잠기도록 주사기 바늘(20G)을 사용하여 장치의 작동하지 않는 부분에 새 튜브 캡을 관통합니다.
      메모: 와이어의 3중 나선 기능 부분은 충전 전반에 걸쳐 셀 서스펜션으로 덮여 있어야 합니다.
   5. 틸트 롤러 믹서의 튜브를 RT에서 30분 동안 5rpm으로 배양합니다.
   6. 1x PBS로 와이어를 세 번 헹구고 육안 검사 때까지 1x PBS가 들어 있는 15mL 튜브에 넣어 어두운 곳에 보관합니다.
      메모: 세포에 해를 끼치지 않도록 와이어의 기능 부분은 항상 물에 잠겨있어야 합니다.
3. 저용량 셀 서스펜션에서 전선 충전(대체 충전 방법: 2.1. 많은 양의 셀 서스펜션을 사용하여 와이어 충전)
   1. 라벨링된 세포를 1x PBS에서 1,000,000 cells/mL로 재현탁합니다.
   2. 150mm 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 랙에 수평으로 고정하십시오.
   3. 보관함에서 와이어를 제거하되 와이어를 고정하는 노란색 고무 캡은 그대로 두십시오.
   4. 기능화된 부분이 유리에 닿지 않도록 파스퇴르 피펫 끝에 위치하도록 피펫에 와이어를 놓습니다.
      메모: 와이어 끝이 파스퇴르 피펫 팁에서 튀어나오지 않아야 합니다. 파스퇴르 피펫 팁의 뒤쪽 끝을 와이어를 고정하는 고무 캡으로 막지 마십시오. 단단히 부착하면 셀 현탁액을 다른 쪽에서 피펫 팁으로 로드할 수 없습니다.
   5. 15μL의 세포 현탁액을 와이어의 기능화된 부분을 덮고 있는 파스퇴르 피펫 팁에 로드합니다.
   6. 와이어를 10분 동안 배양합니다. 조립된 와이어/파스퇴르 피펫 팁을 1분마다 수동으로 1/4 돌립니다.
   7. 파스퇴르 피펫 팁에서 와이어를 제거하고 1x PBS 5mL로 헹구고 육안 검사 때까지 1x PBS가 포함된 15mL 튜브에 2-6°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
      메모: 기능 부품은 세포에 해를 끼치지 않도록 항상 1x PBS에 담가야 합니다.

3. 와이어의 셀 계산

참고: 세포에 해를 끼치지 않도록 항상 와이어의 기능 부분을 1x PBS에 담그십시오.

1. 그리스 펜을 사용하여 유리 슬라이드에 직사각형 영역을 그리고 500μL의 1x PBS를 추가합니다.
2. 와이어의 작동하지 않는 부분을 구부리고 기능 부분이 1x PBS에 잠기도록 유리 슬라이드에 놓습니다.
   메모: 직사각형의 면적과 1x PBS의 부피를 맞추어 전선의 기능적인 부분을 완전히 덮습니다. 양면 접착 테이프를 사용하여 와이어의 작동하지 않는 부분을 슬라이드에 장착합니다.
3. 와이어의 양쪽을 육안으로 검사하여 캡처된 셀을 열거합니다(그림 1B 및 1F).
   메모: 세포의 존재는 DAPI 및 FITC용 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 측정됩니다. 와이어의 양면을 검사할 수 있으며 셀 수를 평가하거나(높은 셀 수의 경우) 계수할 수 있습니다(적은 수의 셀이 와이어에 부착된 경우에만 가능). 셀 열거가 필요하지 않은 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
4. 스캔 후 1x PBS가 들어 있는 15mL 튜브에 와이어를 다시 넣고 어두운 곳에 보관합니다.
   메모: 와이어의 작동하지 않는 부분의 대부분을 절단하고(굽힘 포함) 제거할 수 있어 보관이 용이합니다.

4. 표적 세포의 분리 및 회수

참고: 격리 후 4시간 이내에 격리해야 합니다.

1. 1x PBS mL당 4mg의 방출 완충액 성분(재료 및 시약 표)을 용해하고 0.2μm 멸균 필터를 통해 용액을 여과하여 즉시 사용할 수 있는 완충액을 얻습니다.
   메모: 와이어의 폴리머는 항 EpCAM 항체로 기능화되어 EpCAM 제시 표적 세포에 결합할 수 있는 하이드로겔로 구성됩니다. 방출 완충액에는 하이드로겔을 절단할 수 있는 탄소-산소 단백질 분해 효소가 포함되어 있습니다. 단백질 분해 절단은 고분자의 분해를 초래하여 포획된 세포의 분리를 초래합니다.
2. 방출 버퍼를 37°C에서 5분 동안 예열합니다.
3. 1.6mL의 릴리스 버퍼를 추가하여 1.5mL 반응 튜브를 채웁니다.
   메모: 1.5 mL 반응 부피용으로 설계된 튜브는 와이어의 기능적 부분을 담그는 데 필요한 1.6 mL의 도포가 가능합니다.
4. 37°C(수조)에서 20분 동안 방출 버퍼에 있는 와이어의 기능 부분을 배양합니다. 튜브 캡 대신 와이어와 함께 제공된 고무 캡을 사용하여 수조에서 배양하는 동안 오염을 방지하기 위해 1.5mL 튜브에 와이어를 고정합니다.
5. 와이어/튜브 어셈블리를 RT 및 500rpm에서 15분 동안 셰이커로 옮깁니다.
   메모: 셰이커의 궤도는 1.5mm입니다.
6. 와이어/튜브 어셈블리를 원심분리기에 놓고 300 x g에서 10분 동안 회전시킵니다.
7. 튜브에서 와이어를 제거하고 캡을 닫은 다음 300 x g에서 10분 동안 튜브를 다시 원심분리
   메모: 와이어는 세포 계수를 위해 어둠 속에서 2-6°C의 1x PBS에 보관하여 분리 효율을 평가하고 와이어에 남아 있는 세포를 확인할 수 있습니다.
8. 세포 현탁액의 부피를 줄이려면 상층액의 100 μL(미세 조작) 또는 300 μL(세포 원심분리 및 후속 레이저 현미해부)를 제외한 모든 것을 제거하고 즉시 단일 세포 샘플링을 진행하십시오.

그림 1: 라벨링된 세포 시각화.(A,E) 충전 전 세포: 세포는 CFSE로 표지되고 CFSE(녹색) 신호 강도 범위를 보여주는 DNA 삽입 염료로 대조염색됩니다. (B,F) 와이어에 캡처된 라벨링된 세포. (C,G) 세포 분리 절차 후 와이어. (D,H) 세포는 와이어에서 분리되어 세포 원심분리에 의해 슬라이드로 회수됩니다. CFSE: FITC 채널(녹색). DNA 염색: DAPI 채널(파란색).

그림 2: 그림 2: 전선 및 보관함(A) 와이어의 구획.(B) 기능화된 부품의 세부 사항.