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참고: 이 프로토콜은 PBS 또는 HT-29 세포와 말초 혈액의 인공 혼합물에서 HT-29 세포(인간 대장암 세포주)를 분리하는 방법을 설명합니다. 동일한 실험을 두 개의 추가 세포주(LNCaP 및 VCaP)로 수행했으며 이론적으로 EpCAM을 발현하는 모든 세포에 대해 수행할 수 있습니다.
1. 타겟 셀의 준비
- 세포 배양 및 세포 라벨링
메모: 이 프로토콜에서는 세포를 75cm² 배양 플라스크에서 배양합니다. 다른 세포 배양 장치(예: 25cm² 배양 접시, 6웰 플레이트 등)를 사용하는 경우 그에 따라 시약의 양을 조정하십시오. 사용되는 모든 액체는 수조에서 37°C로 예열됩니다. 달리 표시되지 않는 경우 모든 프로토콜 단계는 실온(RT)에서 수행됩니다.
- 2mM L-글루타민, 20mM 헤페, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 McCoy의 5a 변형 배지에서 HT-29 세포를 5% CO2 분위기에서 37°C로 배양합니다.
- 세포가 90% 집중되면 배지를 제거하고 10mL의 1x PBS로 세포를 헹굽니다.
- 세포를 수확하려면 세포 분리 용액(재료 및 시약 표) 2mL를 세포에 추가하고 37°C에서 약 5분 동안 세포를 배양합니다.
메모: 분리 용액에는 1x PBS, 0.5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 3mg/L 페놀 레드의 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소가 포함되어 있습니다. 세포 분리 용액의 사전 예열 시간은 37°C에서 1시간 후에 비활성화되므로 최소로 줄입니다. 최적의 세포 분리를 얻기 위해 전체 세포층을 덮습니다.
- 도립 현미경을 사용하여 세포의 분리를 확인합니다.
- 분리된 모든 세포를 10mL의 세포 배양 배지가 미리 채워진 50mL 튜브(1.1.1단계에서 사용한 것과 동일)로 옮기고 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다.
- 나머지 셀 현탁액을 RT의 수평 롤러 믹서에 놓고 라벨링 단계를 진행합니다.
- 타겟 세포의 살아있는 세포 라벨링
- 37°C에서 예열된 1x PBS 1mL에 5mM CFSE(디메틸 설폭사이드, DMSO로 제공) 1μL를 희석하여 즉시 사용 가능한 5μM CFSE 라벨링 솔루션을 얻습니다.
메모: 최적의 염색 결과를 얻으려면 새로 준비된 용액을 사용하십시오.
- 1x PBS에 바로 사용할 수 있는 DNA 염색 용액(재료 및 시약 표)을 준비하고 빛으로부터 보호된 2-6°C에서 보관합니다.
메모: 최적의 염색 결과를 얻으려면 새로 준비된 용액을 사용하십시오.
- 수평 롤러 믹서(step 1.1.6.)에서 세포를 추출하고 300 x g에서 10분 동안 세포를 펠렛화합니다. 상층액을 제거하고 1x PBS 10mL에 세포를 재현탁합니다.
- 1x PBS로 세포를 다시 헹구고 세포 펠릿을 즉시 사용 가능한 500μL CFSE 라벨링 용액에 재현탁합니다.
- 37°C에서 15분 동안 세포를 배양하고 300 x g에서 3분 동안 원심분리 후 세포를 수집합니다.
- 예열된 세포 배양 배지 1mL에 라벨링된 세포를 재현탁하고 세포가 37°C에서 30분 동안 재생되도록 합니다.
- 300 x g에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고 세포 펠릿을 37°C에서 10분 동안 즉시 사용할 수 있는 DNA 염색 용액 1mL에 재현탁합니다.
- 세포를 펠렛화하고 상층액을 제거한 다음 1x PBS 4mL에 세포를 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포 밀도를 평가하고 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 및 fluorescein isothiocyanate(FITC) 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 형광 표지를 확인합니다(그림 1A 및 1E).
- 300 x g에서 3분 동안 세포를 원심분리하고 다음 섹션과 같이 각 실험에 필요한 세포 밀도에 따라 세포 펠렛을 재현탁하고 얼음 위에 놓습니다.
2. 전선 충전
참고: 세포는 표적 세포/말초 혈액 스파이크에서 밀리리터 규모로 분리하거나 마이크로리터 규모에서 적은 수의 세포를 제공함으로써 분리할 수 있습니다. 전자의 접근 방식은 말초 혈액의 희귀 세포 상태를 모방할 수 있는 반면, 후자는 프로토콜 최적화/테스트를 위해 몇 개의 세포를 부착하는 데 선호되는 방법일 수 있습니다.
- 많은 양의 셀 서스펜션을 사용하여 전선 충전
- 1x PBS 40mL에 BSA 0.8g을 용해하여 2% BSA 차단 용액을 준비합니다(세포 배양 사용). 초기 와류를 통해 BSA를 용해시키고 이후 수평 롤러 믹서에서 RT에서 10-20분 동안 배양합니다.
- 빈 EDTA 튜브/헤파린 나트륨 튜브를 2% BSA 2mL로 헹구어 항응고제 잔류물을 제거하고 용액을 버립니다. 수평 롤러 믹서에서 15rpm으로 30분 동안 2% BSA 5mL를 사용하여 RT에서 배양하여 튜브 표면을 막고 용액을 폐기합니다.
- 라벨링된 세포(섹션 1.2.)를 100,000 cells/mL의 밀도로 희석하고 5mL를 사용하여 와이어를 충전합니다.
- 라벨링된 세포 현탁액 5mL(총 500,000개 세포)를 튜브에 추가합니다. 세포 현탁액을 추가할 때 기포를 피하십시오.
- 보관함에서 전선과 전선을 고정하는 고무 캡을 분리하고 1x PBS로 헹굽니다(그림 2).
- 주사기 바늘(20G)을 사용하여 EDTA 튜브의 고무 튜브 캡(단계 2.1.4)을 관통하고 캡이 튜브에 다시 연결되고 튜브가 기울어진 롤러 믹서에 놓일 때 기능 부품이 셀 서스펜션에 완전히 잠기도록 와이어를 삽입합니다.
메모: 와이어의 3중 나선 기능 부분은 충전 전반에 걸쳐 셀 서스펜션으로 덮여 있어야 합니다.
- 기울어진 롤러 믹서의 튜브를 5rpm에서 30분 동안 회전하여 셀이 와이어에 부착될 수 있도록 합니다.
- 와이어를 5mL 1x PBS로 헹구고 육안 검사 때까지 1x PBS가 포함된 15mL 튜브에 2-6°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
메모: 와이어의 기능 부분은 세포에 해를 끼치지 않도록 항상 PBS에 담가야 합니다.
- 말초 혈액과의 인위적인 혼합물로부터 표적 세포를 분리(대체 충전 방법: 2.1. 많은 양의 셀 서스펜션을 사용하여 와이어 충전)
- 표지된 세포를 희석하여(섹션 1.2.) 높은 세포 밀도(> 1,000,000 cells/mL)를 가진 세포 현탁액을 얻어 말초 혈액에 추가된 세포 현탁액의 부피를 낮게 유지합니다.
- 500-500,000개의 세포를 5mL의 말초 혈액에 추가하고 튜브를 거꾸로 하여 혼합합니다.
- 보관함에서 와이어를 제거하고 와이어를 고정하고 있는 고무 캡을 제거한 다음 1x PBS로 헹굽니다.
캡을 튜브에 - 다시 끼우고 튜브를 기울어진 롤러 믹서에 놓았을 때 기능 부분이 스파이크된 혈액에 완전히 잠기도록 주사기 바늘(20G)을 사용하여 장치의 작동하지 않는 부분에 새 튜브 캡을 관통합니다.
메모: 와이어의 3중 나선 기능 부분은 충전 전반에 걸쳐 셀 서스펜션으로 덮여 있어야 합니다.
- 틸트 롤러 믹서의 튜브를 RT에서 30분 동안 5rpm으로 배양합니다.
- 1x PBS로 와이어를 세 번 헹구고 육안 검사 때까지 1x PBS가 들어 있는 15mL 튜브에 넣어 어두운 곳에 보관합니다.
메모: 세포에 해를 끼치지 않도록 와이어의 기능 부분은 항상 물에 잠겨있어야 합니다.
- 저용량 셀 서스펜션에서 전선 충전(대체 충전 방법: 2.1. 많은 양의 셀 서스펜션을 사용하여 와이어 충전)
- 라벨링된 세포를 1x PBS에서 1,000,000 cells/mL로 재현탁합니다.
- 150mm 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 랙에 수평으로 고정하십시오.
- 보관함에서 와이어를 제거하되 와이어를 고정하는 노란색 고무 캡은 그대로 두십시오.
- 기능화된 부분이 유리에 닿지 않도록 파스퇴르 피펫 끝에 위치하도록 피펫에 와이어를 놓습니다.
메모: 와이어 끝이 파스퇴르 피펫 팁에서 튀어나오지 않아야 합니다. 파스퇴르 피펫 팁의 뒤쪽 끝을 와이어를 고정하는 고무 캡으로 막지 마십시오. 단단히 부착하면 셀 현탁액을 다른 쪽에서 피펫 팁으로 로드할 수 없습니다.
- 15μL의 세포 현탁액을 와이어의 기능화된 부분을 덮고 있는 파스퇴르 피펫 팁에 로드합니다.
- 와이어를 10분 동안 배양합니다. 조립된 와이어/파스퇴르 피펫 팁을 1분마다 수동으로 1/4 돌립니다.
- 파스퇴르 피펫 팁에서 와이어를 제거하고 1x PBS 5mL로 헹구고 육안 검사 때까지 1x PBS가 포함된 15mL 튜브에 2-6°C의 어두운 곳에 보관하십시오.
메모: 기능 부품은 세포에 해를 끼치지 않도록 항상 1x PBS에 담가야 합니다.
3. 와이어의 셀 계산
참고: 세포에 해를 끼치지 않도록 항상 와이어의 기능 부분을 1x PBS에 담그십시오.
- 그리스 펜을 사용하여 유리 슬라이드에 직사각형 영역을 그리고 500μL의 1x PBS를 추가합니다.
- 와이어의 작동하지 않는 부분을 구부리고 기능 부분이 1x PBS에 잠기도록 유리 슬라이드에 놓습니다.
메모: 직사각형의 면적과 1x PBS의 부피를 맞추어 전선의 기능적인 부분을 완전히 덮습니다. 양면 접착 테이프를 사용하여 와이어의 작동하지 않는 부분을 슬라이드에 장착합니다.
- 와이어의 양쪽을 육안으로 검사하여 캡처된 셀을 열거합니다(그림 1B 및 1F).
메모: 세포의 존재는 DAPI 및 FITC용 필터가 장착된 형광 현미경을 사용하여 측정됩니다. 와이어의 양면을 검사할 수 있으며 셀 수를 평가하거나(높은 셀 수의 경우) 계수할 수 있습니다(적은 수의 셀이 와이어에 부착된 경우에만 가능). 셀 열거가 필요하지 않은 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
- 스캔 후 1x PBS가 들어 있는 15mL 튜브에 와이어를 다시 넣고 어두운 곳에 보관합니다.
메모: 와이어의 작동하지 않는 부분의 대부분을 절단하고(굽힘 포함) 제거할 수 있어 보관이 용이합니다.
4. 표적 세포의 분리 및 회수
참고: 격리 후 4시간 이내에 격리해야 합니다.
- 1x PBS mL당 4mg의 방출 완충액 성분(재료 및 시약 표)을 용해하고 0.2μm 멸균 필터를 통해 용액을 여과하여 즉시 사용할 수 있는 완충액을 얻습니다.
메모: 와이어의 폴리머는 항 EpCAM 항체로 기능화되어 EpCAM 제시 표적 세포에 결합할 수 있는 하이드로겔로 구성됩니다. 방출 완충액에는 하이드로겔을 절단할 수 있는 탄소-산소 단백질 분해 효소가 포함되어 있습니다. 단백질 분해 절단은 고분자의 분해를 초래하여 포획된 세포의 분리를 초래합니다.
- 방출 버퍼를 37°C에서 5분 동안 예열합니다.
- 1.6mL의 릴리스 버퍼를 추가하여 1.5mL 반응 튜브를 채웁니다.
메모: 1.5 mL 반응 부피용으로 설계된 튜브는 와이어의 기능적 부분을 담그는 데 필요한 1.6 mL의 도포가 가능합니다.
- 37°C(수조)에서 20분 동안 방출 버퍼에 있는 와이어의 기능 부분을 배양합니다. 튜브 캡 대신 와이어와 함께 제공된 고무 캡을 사용하여 수조에서 배양하는 동안 오염을 방지하기 위해 1.5mL 튜브에 와이어를 고정합니다.
- 와이어/튜브 어셈블리를 RT 및 500rpm에서 15분 동안 셰이커로 옮깁니다.
메모: 셰이커의 궤도는 1.5mm입니다.
- 와이어/튜브 어셈블리를 원심분리기에 놓고 300 x g에서 10분 동안 회전시킵니다.
- 튜브에서 와이어를 제거하고 캡을 닫은 다음 300 x g에서 10분 동안 튜브를 다시 원심분리
메모: 와이어는 세포 계수를 위해 어둠 속에서 2-6°C의 1x PBS에 보관하여 분리 효율을 평가하고 와이어에 남아 있는 세포를 확인할 수 있습니다.
- 세포 현탁액의 부피를 줄이려면 상층액의 100 μL(미세 조작) 또는 300 μL(세포 원심분리 및 후속 레이저 현미해부)를 제외한 모든 것을 제거하고 즉시 단일 세포 샘플링을 진행하십시오.
