Micromanipulation을 사용한 단일 세포 샘플링: 암세포 현탁액에서 단일 세포를 분리하는 기술

초록

출처: Chen S. et al. 단일 세포 다운스트림 특성화를 위한 표적 세포 사전 농축 및 전체 게놈 증폭. J. Vis. 특급. (2018년)

이 동영상은 다운스트림 분석을 수행하기 위해 표적 세포 풀에서 단일 세포를 분리하는 기술을 설명합니다. 이 방법에서는 현미경에 장착된 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 단일 표적 세포를 고정밀 분리합니다.

프로토콜

1. 단일 셀 샘플링

1. 마이크로 조작
   참고: 전체 게놈 분석(WGA)과 같은 다운스트림 응용 분야를 허용하기 위해 분리된 단일 세포를 2μL의 세포 용해 마스터 믹스에 추가합니다. 처리할 세포의 수에 따라 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫팅으로 인한 손실에 대한 추가 부피를 계산하고 Cell Lysis 마스터 믹스를 얼음 위에 놓습니다.
   1. 세포 용해 마스터 믹스(WGA 키트의 구성 요소, 재료 및 시약 표)를 준비합니다. 간단히 2.0 μL의 반응 완충액, 1.3 μL의 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(10% 용액), 1.3 μL의 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸) 페닐-폴리에틸렌 글리콜(10% 용액), 2.6 μL의 proteinase K 용액 및 12.8 μL RNase/DNase-free water를 혼합하여 10개 시료(총 부피 20 μL)에 대한 마스터 믹스를 얻습니다.
      메모: 더 많은 샘플의 경우 그에 따라 부피를 늘리십시오.      
   2. 그리스 펜을 사용하여 셀 현탁액을 제자리에 고정하는 영역을 그립니다. 세포 밀도가 너무 높을 경우 면적과 부피를 조정합니다(즉, 유리 슬라이드에 더 큰 영역을 표시하고 1x PBS 및 세포 현탁액의 부분 표본을 로드합니다).
   3. 전체 타겟 세포 현탁액을 유리 슬라이드에 피펫으로 주입합니다.
   4. 유리 슬라이드를 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 현미경으로 옮깁니다. 세포가 5분 동안 가라앉도록 합니다.
   5. 2.0μL의 세포 용해 마스터 믹스(1.1.1단계에서 준비)가 로드된 0.2mL PCR 튜브를 준비하고 얼음에 보관합니다.
   6. micromanipulator를 사용하여 1 μL의 1x PBS에서 단일 세포를 수집하고 세포 용해 마스터 믹스가 들어 있는 튜브로 세포를 옮깁니다.
      메모: 미세 조작된 세포를 세포 용해 완충액으로 옮기려면 모세관을 2μL의 용해 용액에 직접 넣고 기포가 보일 때까지 배출합니다.
   7. 탁상용 마이크로필터를 사용하여 2000 x g에서 3초 동안 샘플을 간단히 회전시켜 튜브 바닥에 있는 모든 액체를 수집합니다. 샘플을 얼음 위에 놓습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수(1x PBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10010-015
Vacutainer EDTA(또는 Na-heparin) 튜브	BD (영어)	366450(또는 366480)	타겟 세포의 ex vivo 포획을 위한 반응 튜브로 사용
파스퇴르 피펫 150 mm	볼락	D810	C&R에 세포를 소량 적용하는 데 사용됩니다.
그리스 펜	다코	시즌 2002	세포 현탁액을 제자리에 고정하기 위해 유리 슬라이드에 사용
Mikromanipulator MMJ 및 CellTram vario가 장착된 Axiovert M200	자이스/에펜도르프		즉시 micromanipulation 사용
마이크로 모세관(직경 25μm), CustomTip 유형 I	에펜도르프	930001201	세포를 미세 조작하는 데 사용됩니다.
0.2 mL PCR 튜브	바이오짐	710920

) 년