레이저 캡처 미세해부를 사용한 단일 세포 샘플링: 이질적인 세포 집단에서 표적 세포를 수확하는 기술

Abstract

출처: Chen S. et al. 단일 세포 다운스트림 특성화를 위한 표적 세포 사전 농축 및 전체 게놈 증폭. J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오는 레이저 캡처 현미해부를 사용하여 이질적인 세포 집단에서 단일 세포를 얻는 기술을 설명합니다. 단일 분리 세포는 추가 게놈 연구 또는 암 연구에 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 단일 셀 샘플링

1. 레이저 미해부
   참고: WGA용 세포 용해 마스터 믹스 4.5μL(WGA 키트의 구성 요소, 재료 및 시약 표)에 단일 세포가 추가됩니다.
   1. 반응 완충액 5.0 μL, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 1.3 μL(10% 용액), 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜 1.3 μL(10% 용액), 단백질 분해 효소 K 용액 2.6 μL 및 RNase/DNase-free 물 34.8 μL를 혼합하여 Czyż 등에 따라 세포 용해 마스터 믹스를 준비하여 10개 시료(총 부피 45 μL)에 대한 마스터 믹스를 얻습니다. 마스터 믹스를 얼음에 놓습니다.
      메모: 더 많은 샘플의 경우 그에 따라 부피를 늘리십시오.
   2. 레이저 현미해부에 적합한 멤브레인 코팅된 슬라이드를 UV 처리합니다. 슬라이드를 DNA 가교제 장치에 넣고 약 10분 동안 가장 높은 UV에 노출시킵니다.
   3. 세포원심분리기(cytocentrifuge)에서 멤브레인 코팅된 슬라이드를 조립하고 전체 세포 현탁액을 300 x g에서 5....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy's 5A 미디엄(1x) 보충제 L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제16600-082	HT-29 세포에 사용되는 배양 배지는 실험에 사용되는 세포주에 배양 배지를 적응시킵니다.
HEPES 완충 용액 (1m)	파아	시즌 11-001	McCoy's 5A 미디엄 보충제
태아 소 세럼 골드	파아	대답15-151	McCoy의 5a 변형 배지 보충
페니실린-스트렙토마이신(100x)	바이오웨스트	L0018-100	McCoy의 5a 변형 배지 보충
인산염 완충 식염수(1x PBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10010-015
아카쿠타아제	바이오웨스트	L0950-100	세포 박리 용액(세포 배양)
수조	단골 섬유(GFL)	타입 1003	예열 용액에 사용
부 화기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific		세포 배양에 사용(세포 배양)
50 mL 반응 튜브	폭스바겐	Tel.: 525-0403
롤러 믹서	스튜어트 사이언티픽	SRT6D	세포가 침전되는 것을 막으면서 세포를 와이어에 부착하는 데 사용됩니다.
CellTrace CFSE 세포 증식 키트	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	C34554	살아있는 세포를 라벨링하는 데 사용됩니다(cytoplasmic label).
회스트: 33342	H3570	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	DNA를 염색하는 데 사용(nucleic counterstain)
원심분리기(15 mL 및 50 mL 반응 튜브를 고정할 수 있도록 장착됨)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	헤레우스 메가퍼지 40R	세포를 펠릿화하는 데 사용
Observer Z1 (형광/레이저 현미해부 현미경)	Carl Zeiss 마이크로이미징		레이저 현미해부가 가능한 도립형(면역형광) 현미경; 형광 현미경은 Hoechst 33342(DAPI 필터) 및 CFSE(FITC 필터)를 검출할 수 있어야 합니다.
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A4503-50G	유리/플라스틱 표면 코팅에 사용
MS1 미니셰이커	시그마-알드리치	Z404039	와류에 사용
Detektor CANCER03 DC03	길루피	길003	EpCAMpositive 세포를 분리 및 분리할 수 있는 기능화된 와이어(catch&release, C&R이라고도 함)
주사기 바늘(G20)	폭스바겐	우편번호 613-0554	C&R의 비기능적인 부분이 고무 캡을 통과할 수 있도록 고무 캡에 구멍을 뚫는 데 사용됩니다.
노이바우어 챔버	로스	T729.1	셀 수를 계산하는 데 사용됩니다
파스퇴르 피펫 150 mm	볼락	D810	C&R에 세포를 소량 적용하는 데 사용됩니다.
그리스 펜	다코	시즌 2002	세포 현탁액을 제자리에 고정하기 위해 유리 슬라이드에 사용
델피아 플레이트셰이커	퍼킨 엘머	1296-003	세포 분리 중 교반에 사용
1.5 mL 튜브	에펜도르프	30,125,150
Ampli1 WGA 키트	실리콘 바이오시스템즈		Silicon Biosystems를 통해 주문 가능
0.2 mL PCR 튜브	바이오짐	710920
세포원심분리기 및 장비	헤티치	유니버셜 32	세포 원심분리기를 즉시 사용
써모 사이클러	바이오 라드	DNA 엔진 다이아드	가열된 뚜껑이 있는 모든 열 순환기를 사용할 수 있습니다
마이크로 원심분리기	로스	CX73.1	탁상용 원심분리기를 즉시 사용
UV 스트라탈링커 1800	스트라타젠	400072	DNA 가교제를 즉시 사용