레이저 캡처 미세해부를 사용한 단일 세포 샘플링: 이질적인 세포 집단에서 표적 세포를 수확하는 기술

초록

출처: Chen S. et al. 단일 세포 다운스트림 특성화를 위한 표적 세포 사전 농축 및 전체 게놈 증폭. J. Vis. 특급. (2018년)

이 비디오는 레이저 캡처 현미해부를 사용하여 이질적인 세포 집단에서 단일 세포를 얻는 기술을 설명합니다. 단일 분리 세포는 추가 게놈 연구 또는 암 연구에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 단일 셀 샘플링

1. 레이저 미해부
   참고: WGA용 세포 용해 마스터 믹스 4.5μL(WGA 키트의 구성 요소, 재료 및 시약 표)에 단일 세포가 추가됩니다.
   1. 반응 완충액 5.0 μL, 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 1.3 μL(10% 용액), 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜 1.3 μL(10% 용액), 단백질 분해 효소 K 용액 2.6 μL 및 RNase/DNase-free 물 34.8 μL를 혼합하여 Czyż 등에 따라 세포 용해 마스터 믹스를 준비하여 10개 시료(총 부피 45 μL)에 대한 마스터 믹스를 얻습니다. 마스터 믹스를 얼음에 놓습니다.
      메모: 더 많은 샘플의 경우 그에 따라 부피를 늘리십시오.
   2. 레이저 현미해부에 적합한 멤브레인 코팅된 슬라이드를 UV 처리합니다. 슬라이드를 DNA 가교제 장치에 넣고 약 10분 동안 가장 높은 UV에 노출시킵니다.
   3. 세포원심분리기(cytocentrifuge)에서 멤브레인 코팅된 슬라이드를 조립하고 전체 세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 사이토스핀합니다.
      메모: 세포가 슬라이드 인 용액에 세포 원심분리되는 in-liquid 시스템을 사용하는 경우, 세포 원심분리 후 상층액을 제거하고 1140 x g에서 1분 동안 드라이 스핀을 적용합니다.
   4. 직접 레이저 현미해부를 진행하거나 사이토스핀을 밤새 자연 건조시키고 장기 보관을 위해 샘플을 -20°C에서 동결합니다.
   5. 4.5 μL의 세포 용해 마스터 믹스를 0.2 mL PCR 튜브의 캡에 피펫팅하고 레이저 현미해부를 통해 단일 세포를 수확합니다.
   6. 레이저 현미해부 현미경에서 PCR 튜브를 꺼내고 튜브를 닫습니다. 짧은 스핀으로 튜브 바닥에 있는 모든 액체를 모으고 샘플을 얼음 위에 놓습니다.
   7. 단일 세포 WGA를 진행하거나 추가 처리 전에 최대 1개월 동안 -80°C에서 분리된 샘플을 보관합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
McCoy's 5A 미디엄(1x) 보충제 L-글루타민	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제16600-082	HT-29 세포에 사용되는 배양 배지는 실험에 사용되는 세포주에 배양 배지를 적응시킵니다.
HEPES 완충 용액 (1m)	파아	시즌 11-001	McCoy's 5A 미디엄 보충제
태아 소 세럼 골드	파아	대답15-151	McCoy의 5a 변형 배지 보충
페니실린-스트렙토마이신(100x)	바이오웨스트	L0018-100	McCoy의 5a 변형 배지 보충
인산염 완충 식염수(1x PBS)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	10010-015
아카쿠타아제	바이오웨스트	L0950-100	세포 박리 용액(세포 배양)
수조	단골 섬유(GFL)	타입 1003	예열 용액에 사용
부 화기	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific		세포 배양에 사용(세포 배양)
50 mL 반응 튜브	폭스바겐	Tel.: 525-0403
롤러 믹서	스튜어트 사이언티픽	SRT6D	세포가 침전되는 것을 막으면서 세포를 와이어에 부착하는 데 사용됩니다.
CellTrace CFSE 세포 증식 키트	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	C34554	살아있는 세포를 라벨링하는 데 사용됩니다(cytoplasmic label).
회스트: 33342	H3570	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	DNA를 염색하는 데 사용(nucleic counterstain)
원심분리기(15 mL 및 50 mL 반응 튜브를 고정할 수 있도록 장착됨)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	헤레우스 메가퍼지 40R	세포를 펠릿화하는 데 사용
Observer Z1 (형광/레이저 현미해부 현미경)	Carl Zeiss 마이크로이미징		레이저 현미해부가 가능한 도립형(면역형광) 현미경; 형광 현미경은 Hoechst 33342(DAPI 필터) 및 CFSE(FITC 필터)를 검출할 수 있어야 합니다.
소 혈청 알부민(BSA)	시그마-알드리치	A4503-50G	유리/플라스틱 표면 코팅에 사용
MS1 미니셰이커	시그마-알드리치	Z404039	와류에 사용
Detektor CANCER03 DC03	길루피	길003	EpCAMpositive 세포를 분리 및 분리할 수 있는 기능화된 와이어(catch&release, C&R이라고도 함)
주사기 바늘(G20)	폭스바겐	우편번호 613-0554	C&R의 비기능적인 부분이 고무 캡을 통과할 수 있도록 고무 캡에 구멍을 뚫는 데 사용됩니다.
노이바우어 챔버	로스	T729.1	셀 수를 계산하는 데 사용됩니다
파스퇴르 피펫 150 mm	볼락	D810	C&R에 세포를 소량 적용하는 데 사용됩니다.
그리스 펜	다코	시즌 2002	세포 현탁액을 제자리에 고정하기 위해 유리 슬라이드에 사용
델피아 플레이트셰이커	퍼킨 엘머	1296-003	세포 분리 중 교반에 사용
1.5 mL 튜브	에펜도르프	30,125,150
Ampli1 WGA 키트	실리콘 바이오시스템즈		Silicon Biosystems를 통해 주문 가능
0.2 mL PCR 튜브	바이오짐	710920
세포원심분리기 및 장비	헤티치	유니버셜 32	세포 원심분리기를 즉시 사용
써모 사이클러	바이오 라드	DNA 엔진 다이아드	가열된 뚜껑이 있는 모든 열 순환기를 사용할 수 있습니다
마이크로 원심분리기	로스	CX73.1	탁상용 원심분리기를 즉시 사용
UV 스트라탈링커 1800	스트라타젠	400072	DNA 가교제를 즉시 사용

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