암세포의 전립선 내 주입: 정소성 전립선 암 마우스 모델을 확립하기 위한 암세포 전달 기술

초록

출처: Anker, J. F. et al. 안드로겐 의존성 및 거세 저항성 전립선암의 생물 발광 및 형광 정교 신유전자 쥐 모델. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서는 전립선암 세포를 마우스 모델에 전립선 내 주사를 투여하는 절차를 보여줍니다. 정소성 쥐 모델은 비침습적이고 임상적으로 관련된 환경에서 질병의 기원과 치료 요법에 대한 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 전 마우스 준비

참고: 적절한 적응을 위해 동물의 스트레스를 최소화하기 위해 수술 전 최소 일주일 동안 대학 동물 시설에 쥐를 수용하십시오. 1.1-1.6단계는 외과의의 보조가 수행합니다. 이후의 모든 수술 단계는 외과의가 멸균 장갑과 멸균 기법의 수술 도구를 사용하여 수행합니다.

1. 이소플루란(isoflurane)으로 마우스를 마취합니다(챔버를 통한 유도의 경우 2-5%, 노즈 콘을 통한 유지 관리의 경우 1-3%). 발가락 핀치 반사의 상실에 의한 완전 유도를 확인합니다.
2. 마우스의 무게를 측정하고 진통제 부프레노르핀 s.c.
   최소 0.05mg/kg을 투여합니다. 메모: 마우스 무게 ≥20g은 성공적인 전립선 내 주사에 이상적입니다.
3. 각막 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고 윤활제를 바릅니다.
4. 복부의 모든 털을 면도하십시오.
5. 멸균 비접착 패드를 사용하여 수술용 스크럽을 3회 원형 도포한 다음 멸균 알코올 물티슈를 사용하여 복부를 살균합니다. 복부가 건조되도록 합니다.
   메모: 나머지 수술 절차의 경우 멸균된 장갑과 수술 도구만 사용하여 멸균된 마우스 복부에 접촉해야 합니다.
6. 깨끗한 수술용 현미경의 대물렌즈 바로 아래에 있는 가열 패드의 깨끗한 표면으로 마우스를 누운 상태로 옮깁니다.
7. 복부에 작은 구멍이 뚫린 멸균 드레이프로 마우스를 덮습니다.

2. 전립선 내 주입

참고: 모든 수술 단계를 멸균 상태에서 수행하십시오. 현미경, 마우스 배치 또는 기타 비멸균 물체의 조정은 추가 도움을 받아 수행해야 합니다.

음경보다
1. 위쪽 복부의 정중선과 포피선을 따라 외피를 약 1cm 절개합니다(그림 1D).
2. 층 사이의 가위를 열어 바깥쪽 복부 피부와 안쪽 복부 근육 조직 사이의 결합 조직을 분리합니다.
3. 장이나 방광에 구멍이 나지 않도록 겸자를 사용하여 근육을 들어 올리면서 복부 안쪽 근육도 유사한 절개를 수행합니다(그림 1D).
4. 양측 정낭(그림 1A, 흰색)/전립선 엽(그림 1A, 검은색) 중 하나를 찾는데, 이는 종종 후방, 측방, 방광(그림 1A, 노란색)보다 약간 상위에 있지만 이는 마우스마다 다를 수 있습니다. 전립선 전립선엽(anterior prostate lobes)은 반투명하며 흰색 정낭(seminal vesicles)의 작은 곡률(small opvature)에 붙어 있습니다.
5. 정낭에 구멍을 뚫지 않고 조직에 장력을 가하기 위해 Graefe 조직 집게를 사용하여 정낭의 끝을 부드럽게 들어 올립니다(그림 1E).
6. 세포가 펠릿화되었을 수 있으므로 Myc-CaP matrigel 용액을 이방인 피펫팅(외과 의사 보조원이 수행)으로 혼합하고 기포를 피하기 위해 30 μL(1x10⁶ 세포)를 바늘로 천천히 흡인합니다.
7. 전립선 전립선의 장축과 평행하게 바늘의 경사를 조심스럽게 삽입하십시오. 로브에 30μL를 천천히 주입한 다음 바늘을 천천히 집어넣어 누출을 방지합니다(그림 1F). 전립선 전립선엽의 충혈에 의한 적절한 주사를 확인합니다(그림 1G).
8. 정낭과 전립선을 마우스 바깥쪽에 약 30초 동안 조심스럽게 잡고 모트리겔이 엽 내에서 부분적으로 응고될 수 있도록 합니다. 이 기간 동안 주입된 전립선엽을 누르지 않고 비정형외 종양 발생을 방지하기 위해 멸균 폴리에스테르 팁 어플리케이터를 사용하여 복부의 세포 용액 누출을 수집합니다.
9. 정낭과 주입된 전립선엽을 엽에 압력을 가하지 않고 조심스럽게 복부로 되돌려 놓습니다. 외부화된 조직을 교체하십시오.
10. 5-0 비크릴 흡수성 역절단 바늘 봉합사로 복부 안쪽 근육을 봉합하기 위해 지속적인 봉합사를 수행합니다.
11. 4-0 나일론 모노필라멘트 비흡수성 역절단 바늘 봉합사로 복부 바깥쪽 피부를 봉합하기 위해 단속 봉합사를 수행합니다. 메모: 멸균된 9mm 스테이플을 사용하여 복부 바깥쪽 피부를 닫을 수도 있습니다. 그러나 봉합사와 달리 후속 생물 발광 및 형광 종양 이미징 신호를 방해합니다.
12. 멸균 에탄올 물티슈(외과 의사의 조수가 열림)로 모든 도구를 세척하고 유리 구슬 살균기에 30초 동안 넣습니다. 다음 마우스에 사용하기 전에 도구를 건조시킵니다.
13. 주사기와 바늘을 멸균 식염수(외과 의사의 조수가 개봉)로 세척하여 잔여 마트리겔에 의한 막힘을 방지합니다.
    메모: 모든 수술에는 외과 조무사가 있어야 하며, 모든 비멸균 수술 전 마우스 준비 및 수술 후 마우스 관리를 수행하고 주사 전에 Myc-CaP 마트리겔 용액을 혼합해야 합니다. 시간을 최소화하기 위해 각 전립선 내 마우스 절차에는 20-30분이 필요하므로 외과 의사가 현재 마우스를 봉합하는 동안 외과 의사 보조원은 다음 마우스 준비를 시작할 수 있습니다.

3. 수술 후 마우스 관리

1. 진통제 meloxicam s.c. 1mg/kg을 즉시 투여하고, 수술 후 24시간, 48시간 후에 투여합니다.
2. 생쥐가 발열 패드에 침구를 반쯤 놓지 않은 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다. 수술 후 생쥐가 정상적인 움직임과 활동을 회복할 때까지 최소 30분 동안 생쥐를 모니터링한 후 케이지 바닥에 음식과 함께 깨끗한 케이지에 넣습니다.
3. 또한 적절한 상처 치유, 체중, 그루밍 및 수술 후 보행을 위해 매일 마우스를 모니터링합니다. 싸움의 증거가 있을 경우 쥐를 개별 우리로 분리한다.
4. 수술 후 14일 이내에 남아 있는 봉합사를 제거하십시오.

결과

그림 1 : 전립선 전립선엽, 림프절 배출, 전립선 내 세포 주사를 위한 대표적인 기술. (A) 오른쪽 전립선 앞쪽 엽(검은색, *), 부착된 오른쪽 정낭(흰색), 오른쪽 고환 및 지방 패드(녹색), 방광(노란색), (B) 양측 전립선 배수 대동맥 주위 림프절(주황색), (C) 미세 해부 가위, Graefe 집게, Graefe 조직 집게, 봉합사 절단기가 있는 바늘 홀더, 28게이지 바늘이 있는 50μL 주사기(왼쪽에서 오른쪽으로)의 이미지, (D) 정중선 절개, (E) 정낭 및 전립선 전방 엽 외형성, (F) 전립선 내 주사, (

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Myc-CaP 세포주	증권 시세	CRL-3255	사용 전에 마이코플라스마가 없는지 확인하십시오
미세 해부 가위	로보즈	RS-5910
그레이지 겸자	로보즈	RS-5135
Graefe 조직 겸자	로보즈	RS-5150
Olsen-Hegar 니들 홀더 위드 봉합사 절단기	증권 시세	12002-12
50 μL 주사기 705 RN SYR	해밀턴	7637-01	에틸렌 옥사이드 가스로 살균
28게이지 니들 스몰 허브 RN H	해밀턴	7803-02	포인트 스타일 4, 각도 45°, 길이 0.75인치 에틸렌 옥사이드 가스에 의한 살균
RPMI	지브코	18875-093
FBS(증권 시세	지브코	10437-028
펜슬린/스트렙토마이신	지브코	15140-122
PBS (PBS)	지브코	14190-144
Matrigel 기저막 매트릭스, 페놀 레드 프리, LDEV 프리	코 닝	356237	4°C의 얼음에 하룻밤 동안 해동 사용하기 전에
이소플루란	헨리 샤인	제11695-0500-2	노스웨스턴대학교 비교의학센터(CCM)로부터 인수
부프레노르핀 하이로클로라이드 0.3 마그네슘/mL		제12496-0757-5	규제 물질, 획득 노스웨스턴 대학교 CCM에서
26 5/8 게이지 주사기	BD (영어)	309597	멜록시캄(meloxicam)과 부프레노르핀 주사용
안과 연고 윤활제	애크런	17478-162-35
베타딘 수술용 스크럽 (포비도네요오드, 7.5%)	퍼듀 제품	67618-151-16
멸균 비접착 패드	무어 메디컬	10775
멸균 알코올 물티슈	피셔 사이언티픽	전화: 22-363-750
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