화학저항성 전립선암세포 생성: 약물 저항성 암세포를 체외에서 획득하는 절차

초록

출처: Mohr, L. et al. 항유사분열제 Docetaxel에 대한 내성의 전립선암 세포 모델 생성. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 전립선암의 탁산 내성 세포 모델을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 모델은 전립선암 환자에서 도세탁셀 내성 진행과 관련된 경로를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 도세탁셀 내성 전립선암 세포의 생성

참고: IC50 약물 농도 측정에 사용되는 Docetaxel 용액을 사용하여 세포 처리를 수행합니다(실험용으로 충분한 재고를 미리 준비). 모세포는 전체 절차에 걸쳐 작은 플라스크에서 병렬로 성장해야 하며 도세탁셀 처리 플라스크에 사용된 양을 모방한 해당 부피로 비히클(DMSO)에 노출되어야 합니다.

1. 20mL의 배지(3.5 x 10, DU145의 경우 플라스크당⁶개 셀, 22Rv1의 경우 플라스크당⁶개 셀)를 포함하는 150cm 플라스크 2개의 DU145 또는 22Rv1 세포 플레이트. 프로토콜이 끝날 때 충분한 세포를 갖기 위해 10-20개의 세포 플라스크를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 24시간 후, 세포가 약 70-80% 합류할 때(그림 1B, Docetaxel 전) IC50 농도(이 프로토콜에 설명된 세포의 경우 5nM)에서 Docetaxel을 추가합니다.
3. 72시간 후, 약물 함유 배지를 흡인하고 새로운 도세탁셀이 없는 배지를 추가합니다(그림 1B, 도세탁셀 후 72시간 후). 3-4일마다 미디어를 교체하십시오. 약 1-2주 이내에 내성 클론이 현미경으로 뚜렷하게 나타납니다(그림 1B, 7일 및 14일 후 Docetaxel).
4. 배지를 흡인하고 15mL PBS로 세포를 조심스럽게 세척한 다음 37°C에서 3-5분 동안 4mL 0.05% 트립신-EDTA를 배양하여 플라스크 표면에서 세포를 분리합니다.
5. 8mL의 신선한 배지를 사용하여 플라스크에서 트립신화된 세포를 재현탁합니다. 처리된 모든 플라스크의 풀 세포. 원심분리에 의한 펠렛 세포(300 x g, 3분, RT).
6. 상등액을 제거하고 세포 펠렛을 20mL의 신선한 배지에 재현탁시킨 다음 150cm² 플라스크(DU145의 경우 플라스크당^3.5 x 10, 6 셀, 22Rv1의 경우 플라스크당⁶셀)에 세포를 플레이트
링합니다.
7. 24시간 후 세포가 약 70-80% 합류할 때 5nM Docetaxel(초기 IC50 농도)을 다시 추가합니다.
8. 3일차에 1.3-1.6단계를 반복합니다.
9. 24시간 후 세포가 약 70-80% 합류하면 2X IC50 Docetaxel 농도(이 프로토콜에 설명된 세포의 경우 10nM)로 처리합니다.
10. 도세탁셀 농도(25 nM, 50 nM, 100 nM 및 250 nM)의 용량 증량 후 1.3-1.8단계를 반복하여 최종 최고 농도에서 플라스크에서 성장하는 안정적인 세포 집단을 생성합니다. 더 높은 농도의 경우 1,000nM 농도에 도달할 때까지 최대 6개월 동안 용량 증량 프로토콜을 구현할 수 있습니다(그림 2A).

결과

그림 1: 도세탁셀 내성 전립선암 세포 모델 시스템의 생성.(A) 부모 전립선암 세포주 DU145 및 22Rv1에서 Docetaxel IC50의 측정을 보여주는 다이어그램(프로토콜의 1단계). 세포 생존율의 예상 비율과 필요한 도세탁셀 용량 증량 농도가 포함됩니다. 대표적인 DU145 및 22Rv1 세포 생존율 그래프는 도세탁셀(Docetaxel) 노출 72시간 후 IC50으로 5nM을 나타냅니다. 실험은 3회이며 데이터는 평균 ± SD를 나타냅니다. (B) 도세탁셀 내성이 생성되는 동안 표시된 시간에 DU145 및 22Rv1 세포의 대표적인 명시야 현미경 이미지(프로토콜의 2단계). 빨간색 화살표는 프로토콜이 완료된 후 Docetaxel 내성 클론을 나타냅니...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DU145 셀	증권 시세	HTB-81
22Rv1 세포	증권 시세	CRL-2505
도세탁셀	Selleck 화학 물질	S1148	DMSO에서 (10mM)
조직 배양 플라스크 150cm^{2}	송골매	355001
RPMI 1640 미디엄	지브코	11875093	10% FBS 및 보충 1% 페니실린/스트렙토마이신
파운데이션 B 소 태아 세럼	쌍둥이자리	900208
1X 인산염 완충 식염수 (PBS)	코 닝	21-040-CM
0.05%트립신-EDTA	지브코	제25300-062
페니실린-스트렙토마이신	지브코	15140122

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