전립선암 세포의 ADI 기반 자가포식 유도: 세포의 자가포식 반응을 측정하기 위한 효소 기반 기술

1. 라이브 이미징을 위한 세포 준비

1. 35mm 폴리-D-라이신으로 코팅된 유리 바닥 배양 접시에서 10% FBS와 1% 항생제를 함유한 RPMI 배양 배지에서 녹색 형광 단백질 결합 경쇄 3(LC3-GFP)을 발현하는 CWR22Rv1 세포를 성장시킵니다. 세포는 빠른 증식을 촉진할 수 있도록 충분한 밀도로 도말해야 하지만, 이미징 시점까지 세포가 과도하게 자라거나 뭉쳐서는 안 됩니다.
2. 선택한 세포 샘플을 PBS에서 ADI(0.3μg/mL)로 처리합니다.
3. 이미징 약 1시간 전에 1.5μl의 LysoTracker Red DND-99(Invitrogen, CA)를 10% FBS 및 1% 항생제가 포함된 20mL RPMI로 희석합니다. 선택한 샘플에 대해 ADI가 포함된 솔루션을 사용합니다. 배양 접시에 추가하기 전에 모든 배지를 37°C로 예열합니다.
4. LysoTracker Red DND-99를 함유한 RPMI로 37°C에서 15-45분 동안 세포를 배양합니다.
5. 이미징하기 약 30분 전에 WeatherStation 환경 인클로저를 켜고 37°C 및 5% CO₂(가습 공기 포함)로 평형을 이룹니다.
6. PBS로 세포를 세척하고 배지를 10%의 FBS와 1%의 항생제만 함유된 표준 RPMI로 교체합니다. 표시된 대로 샘플에 ADI를 추가합니다.
7. 35mm 커버 유리 바닥 배양 접시를 맞춤형 어댑터(Applied Precision, Inc., WA)에 장착하고 현미경 스테이지에 배치합니다. 60X 1.42 NA 대물 렌즈에 이멀젼 오일(굴절률 1.520)을 사용하고 장착된 배양 접시를 스테이지에 배치합니다.

2. 초해상도, 구조 조명(OMX) 현미경 검사

참고: 이 섹션의 프로토콜은 OMX 구조화 조명 현미경(Applied Precision, WA)의 사용에 적용됩니다.

1. 주 전원과 원하는 레이저(410nm, 488nm 및/또는 532nm)를 켭니다. 레이저가 열적으로 안정화될 때까지 20분 동안 기다립니다.
2. 60X 1.42 NA 대물 렌즈에 이멀젼 오일(RT에서 고정 샘플의 경우 굴절률 1.516)을 추가합니다. 기름 방울에 거품이 보이면 대물렌즈를 청소하고 오일을 다시 추가하십시오.
3. 샘플 슬라이드를 스테이지에 놓고 필요한 경우 세포가 커버슬립에 정착할 때까지 10분 동안 기다립니다.
4. 획득 프로그램을 초기화합니다. 형광 조명을 사용하여 세포의 선명한 윤곽이 보일 때까지 초점을 조정합니다.
   메모: 실제 이미지 획득이 이루어질 때까지 형광 여기(fluorescence excitation)에 대한 세포의 노출을 최소화하기 위해 항상 주의를 기울여야 합니다.
5. 나선형 모자이크 스캔을 획득하여 샘플의 더 넓은 영역을 미리 보고 관심 세포 또는 영역을 선택할 수 있습니다. 샘플을 스캔하거나 대상을 찾는 동안 짧은 노출 시간(1-10msec)과 낮은 여기력(0.1-1% 투과율)을 사용하는 것이 좋습니다.
6. GFP-LC3 형광으로 자가포식소체를 식별합니다. Alexa Fluor 555 anti-LAMP(리소좀 관련 막 단백질)로 리소좀을 식별하고 DAPI(고정 샘플)를 사용하여 세포핵을 식별합니다.
7. 여기 파장, 이미지 영역(예: 512x512), 스택 두께, 노출 시간 및 레이저 투과율을 포함한 실험 조건을 선택합니다. 슈퍼 해상도 이미지의 경우 structured illumination 옵션이 활성화되어 있는지 확인하십시오. OMX에서 디콘볼루션 현미경을 사용하려면 기존 조명 옵션을 선택하십시오.
8. 최상의 재구성 결과를 얻으려면 획득하는 동안 최대 intensity count가 10,000에서 15,000 사이가 되도록 실험 조건을 선택합니다. 광표백이 우려되는 경우 더 낮은 노출(5,000에서 10,000 사이)에서 이미징을 사용할 수 있습니다. 이상적으로는 전체 획득 중에 개수가 2배 이상 감소하지 않아야 하며 4배 이상 감소하지 않아야 합니다. 필요한 경우 지속적인 강도 계산을 보장하기 위해 스택 두께를 줄입니다. 카메라는 64,000카운트로 포화되므로 최대 강도는 이를 초과해서는 안 됩니다. 좋은 샘플의 경우, 실험 조건은 1% 레이저 투과율에서 10~50msec의 노출 시간임을 발견했습니다. 반복적으로 이미지화할 수 있는 밝고 광안정성 샘플이 선호됩니다. 타임랩스, 초고해상도 이미지에는 안정적인 얼룩이 필요합니다.
9. 노이즈를 줄이려면 95MHz 판독 속도(중간 속도 옵션)와 2msec 이상의 획득 시간이 권장됩니다. 수집된 이미지에서는 수집 중에 샘플이 이동할 때 증가된 아티팩트가 얻어집니다. 이러한 효과로 인해 부착되지 않거나 빠르게 움직이는 세포에는 짧은 노출이 권장됩니다.
10. 멀티채널 이미징은 동시 또는 순차적으로 수행할 수 있습니다. 순차 모드는 누화가 적으므로 권장됩니다.
11. 광표백을 줄이려면 일반적으로 먼저 더 긴 여기 파장(532nm, 488nm, 410nm)으로 이미징하는 것이 좋습니다. 그러나 그림 1에 표시된 실험 결과의 경우 이 특정 샘플의 광안정성으로 인해 이 순서가 반전되었습니다(즉, 48nm, 532nm 및 410nm).
12. 세포의 상단/하단이 약간 초점에서 벗어날 때까지 현미경 스테이지를 이동하여 Z 스택의 상한/하한을 설정합니다. 재구성 소프트웨어가 이 값을 기본값으로 사용하므로 초고해상도 이미징의 경우 각 이미지 사이의 원하는 거리를 0.125μm로 일정하게 유지해야 합니다.
13. SoftWorX(Applied Precision, WA)를 사용하여 이미지 스택을 재구성하고 VoloCITY 6.0(Perkin Elmer, MA)을 사용하여 분석할 수 있습니다.

그림 1. 세포의 자가포식솜 및 리소좀 분포.A. 위) OMX 현미경을 사용하여 DV 모드(시뮬레이션된 광시야 디콘볼루션, 왼쪽)와 구조화 조명 모드(오른쪽)에서 획득 및 재구성한 이미지를 나란히 비교한 모습. 스케일 바는 5μm를 나타냅니다. B. Bottom) 자가포식소체와 리소좀의 소규모 공동 국소화(화살표로 표시).