단백질 추출 및 단백질 분해: 전립선 종양 조직 샘플에서 단백질을 얻고 효소를 통해 펩타이드로 분해하는 방법

초록

출처: Cheng, L. C. et al. 전립선암의 인산단백질체를 조사하기 위한 무표지 정량 질량분석법과 결합된 인산펩타이드 농축. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 전립선 종양 조직에서 펩타이드를 얻기 위한 단백질 추출 및 소화 기술을 설명합니다. 추가 분석을 통한 이러한 펩타이드는 발암요법의 새로운 표적을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 단백질 추출

1. 용해 완충액을 준비합니다(표 1). (부피는 수확할 샘플의 수에 따라 다릅니다.)
2. 조직 채취
   1. 종양의 무게를 측정하고 배양 시험관에 조직 100mg당 2mL의 얼음처럼 차가운 용해 완충액을 추가합니다. (일반적으로 50-150mg의 조직 습윤 중량이 필요합니다.)
3. 휴대용 또는 탁상용 균질화기를 사용하여 용해물을 균질화합니다(15초 동안 2회 펄스). 첫 번째 샘플 전과 샘플 사이를 10% 표백제, 70% 에탄올 및 탈이온수를 연속적으로 사용하여 균질기를 청소합니다.
4. 환원 및 알킬화하려면 균질화된 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열합니다. 그런 다음 얼음에 15분 동안 식힙니다. 얼음 위에서 용해물을 3번 초음파 처리합니다(즉, 펄스 사이에 60초 동안 일시 중지로 30초 동안 펄스). 이 시점에서 샘플은 점성이 있거나 덩어리가 없어야 합니다. 용해물을 95°C에서 5분 동안 가열합니다.
5. 15°C에서 3,500 x g, 15분 동안 스윙 버킷 로터를 사용하여 동일한 초음파 처리 튜브에서 용해물을 원심분리하고 상등액을 수집하고 펠릿을 폐기합니다.
6. Bradford 분석을 수행하여 단백질 농도를 측정합니다. 필요한 경우 용해 완충액을 사용하여 5mg/mL로 희석합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
   참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플을 -80°C에서 동결하고 추가 분석에 사용합니다.

2. 용해물 분해

1. 구아니디늄의 양을 줄이기 위해 100mM Tris(pH = 8.5)를 사용하여 샘플을 12배 희석합니다. 모든 샘플을 동일한 부피로 희석하여 불균등한 분해의 영향을 최소화합니다. 소화되지 않은 용해물 12.5 μg을 저장하여 Coomassie-stained gel에서 확인합니다.
2. 단백질 5mg의 경우 10μg의 Lysyl Endopeptidase (Lys-C)를 첨가하고 실온에서 5-6 시간 동안 배양합니다.1M untitrated Tris (pH ~ 11)를 추가하여 pH를 8.0으로 조정합니다.
3. 1mM HCl(20mM CaCl₂ 포함)에서 L-1-토실아미도-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤(TPCK) 처리된 트립신 1mg/mL를 준비합니다. 트립신을 1:100 트립신:단백질 비율로 첨가하고 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
4. 2.3단계와 동일한 양의 신선한 트립신을 추가합니다. 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
5. Coomassie-stained gel에서 완전한 소화를 확인하기 위해 분해된 용해물 12.5 μg을 저장하십시오.

3. 역상 추출

1. 용해물 부피를 기록합니다. 15mL 10kDa 컷오프 필터를 사용하여 샘플을 필터링합니다. 15°C에서 스윙 버킷 로터(또는 고정각 로터의 경우 3,500 x g)를 사용하여 잔류물 부피가 250μL 미만이 될 때까지 3,500 x g에서 시료를 원심분리합니다(약 45-60분 소요). 플로우 스루를 수집하고 잔류물을 폐기합니다.

표 1: 버퍼 및 솔루션.이 표는 이 프로토콜에 사용되는 버퍼 및 솔루션의 구성을 보여줍니다.

합니다. . 나트륨

완충기	음량	구성
6 M guanidinium chloride 용해 완충액	50 밀리리터	6 M 구아니디늄 클로라이드, 100 mM 트리스 pH 8.5, 10 mM 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀, 40 mM 클로로아세트아미드, 2 mM 오르토바나데이트 나트륨, 2.5 mM 피로인산나트륨, 1 mM β-글리세로인산염, 500 mg n-옥틸-글리코시드, 초순수 부피
100 mM 피로인산나트륨	50 밀리리터	2.23g 피로인산나트륨 12수화물, 초순수 부피
1M β-글리세로인산염	50 밀리리터	15.31g β-글리세로인산염, 초순수 부피
5% 트리플루오로아세트산	20 밀리리터	100% 트리플루오로아세트산 1mL를 19mL의 초순수에 첨가
0.1% 트리플루오로아세트산	250 밀리리터	5mL 5% 트리플루오로아세트산을 245mL 초순수에 첨가
pY 용리 완충액	250 밀리리터	0.1% 트리플루오로아세트산, 40% 아세토니트릴, 초순수 부피
pST 용리 완충액	250 밀리리터	0.1% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴, 초순수 부피
IP 바인딩 버퍼	200 밀리리터	50mM 트리스 pH 7.4, 50mM 염화나트륨, 초순수 부피
25mM 중탄산암모늄, pH 7.5	10 밀리리터	19.7 mg을 10 mL 멸균 초순수에 용해시키고 1 N 염산(~10-15 μL/10 ml 용액)으로 pH를 7.5로 하여 신선하게 만듭니다
1M 인산염 완충액, pH 7	1,000 밀리리터	423 mL 1 M 인산이수소나트륨, 577 mL 1 M 인산수소
평형 버퍼	14 밀리리터	6.3mL 아세토니트릴, 280μL 5% 트리플루오로아세트산, 1740μL 젖산, 5.68mL 초순수
헹굼 버퍼	20 밀리리터	9mL 아세토니트릴, 400μL 5% 트리플루오로아세트산, 10.6mL 초순수
질량 분석 솔루션	10 밀리리터	500μL 아세토니트릴, 200μL 5% 트리플루오로아세트산, 9.3mL 초순수
버퍼 A	250 밀리리터	5mM 인산일칼륨(pH 2.65), 30% 아세토니트릴, 5mM 염화칼륨, 초순수 부피
버퍼 B	250 밀리리터	5mM 인산일칼륨(pH 2.65), 30% 아세토니트릴, 350mM 염화칼륨, 초순수 부피
0.9% 수산화암모늄	10 밀리리터	300μL 29.42% 수산화암모늄, 9.7mL 초순수

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
초저온 냉동고	파나소닉	MDF-U76V
냉동고 -20 °C	폭스바겐	SCPMF-2020
스윙 로터 버킷	써모피셔 사이언티픽	75004377
엔드 오버 엔드 로테이터	써모피셔 사이언티픽	415110Q (영문)
단백질 결합이 낮은 Eppendorf 튜브	에펜도르프	22431081
트립신, TPCK 처리	워딩턴 생화학 물질	LS003740
리실 엔도펩티다아제	와코 퓨어 케미컬 인더스트리즈(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)	제125-05061
MilliQ 워터			모든 용액 및 완충액을 준비하는 데 사용되는 탈이온수
음파 디스멤브레이터	피셔 사이언티픽	FB-120	초음파 처리기
Polytron 시스템 PT	키네마티카 AG	태평양 표준시 10-35 GT	균질 화기

시리즈 호