펩타이드 정제: 분해된 단백질 용해물에서 펩타이드를 추출하는 RP-HPLC 기반 기법

초록

출처: Cheng, L. C. et al. 전립선암의 인산단백질체를 조사하기 위한 무표지 정량 질량분석법과 결합된 인산펩타이드 농축. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 분해된 단백질 용해물 혼합물에서 펩타이드를 정제하기 위한 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 시연합니다. 이러한 정제된 펩타이드는 그런 다음 동결건조되어 다운스트림 응용 분야를 위해 저장됩니다. 펩타이드 분석은 세포 신호 전달 및 암과 관련된 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

1. 역상 추출

1. 미리 소화된 단백질 용해물을 유리 바이알에 넣고 시작합니다. 15mL 10kDa 컷오프 필터를 사용하여 샘플을 필터링합니다. 15°C에서 스윙 버킷 로터(또는 고정각 로터의 경우 3,500 x g)를 사용하여 잔류물 부피가 250 μL 미만이 될 때까지 3,500 x g에서 시료를 원심분리합니다(약 45 - 60분 소요). 플로우 스루를 수집하고 retentate.
   를 폐기합니다. 참고: 여기서 실험을 일시 중지 할 수 있습니다. 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 -80°C에서 동결합니다.
2. 샘플을 산성화하려면 용해물 mL당 약 20μL의 5% 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가합니다. 잘 섞어 pH 스트립을 사용하여 샘플 pH를 측정합니다. 5% TFA를 사용하여 pH를 2.5로 조정합니다.
3. C-18 컬럼의 짧은 쪽 끝을 진공 매니폴드에 연결합니다. 진공을 17kPa에서 34kPa 사이로 설정하십시오(또는 제조업체의 지침에 따라). 유리 피펫을 사용하여 100% 아세토니트릴(ACN) 3mL로 컬럼을 적십니다. 기둥을 건조시키지 마십시오.
4. 유리 피펫을 사용하여 6mL의 0.....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
초저온 냉동고	파나소닉	MDF-U76V
냉동고 -20 °C	폭스바겐	SCPMF-2020
스윙 로터 버킷	써모피셔 사이언티픽	75004377
진공 매니폴드	레스텍	26080
동결건조기	랩콘코	7420020
CentriVap 탁상용 진공 농축기	랩콘코	7810010
Amicon Ultra-15 원심 필터 장치	밀리포어 시그마	UFC901024
엔드 오버 엔드 로테이터	써모피셔 사이언티픽	415110Q (영문)
유리 배양 튜브	피셔 사이언티픽	제14-961-26
파라필름	피셔 사이언티픽	제13-374-12
20G 바늘	BD (영어)	B305175
킴와이프	피셔 사이언티픽	06-666ᅡ
스크류 캡 cryotube	써모피셔 사이언티픽	379189
Nunc 15 mL 코니컬 튜브	써모피셔 사이언티픽	Tel.: 12-565-268
단백질 결합이 낮은 Eppendorf 튜브	에펜도르프	22431081
3 mL 주사기	BD (영어)	309657
트리플루오아세트산(TFA)	피셔 사이언티픽	파이-28904
아세토니트릴(ACN)	피셔 사이언티픽	대답21-1
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