인산펩타이드 농축: 복합 펩타이드 혼합물에서 특정 인산화 펩타이드를 분리하는 항체 기반 면역침전 기법

초록

출처: Cheng, L. C., et al. 전립선암의 인산단백체를 조사하기 위한 무표지 정량 질량 분석법과 결합된 인산펩타이드 농축. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오에서는 펩타이드 혼합물에서 포스호펩타이드의 항체 기반 면역침전을 보여줍니다. 농축된 인산펩타이드는 진공 농축되어 다운스트림 분석을 위해 보관됩니다.

프로토콜

1. pY 펩타이드의 면역침전 및 농축

1. 정제된 펩타이드 분해물의 동결건조된 분말을 각 분획에 0.5mL의 얼음-저온 면역침전(IP) 결합 완충액으로 재현탁합니다. 0.5mL 재부유 부피를 두 번째 분획에서 첫 번째 분획으로 전달하여 분획을 풀링하고 피펫 팁을 저장합니다. (위아래로 피펫팅하는 대신) 격렬하게 와류를 일으켜 샘플이 완전히 용해되었는지 확인한 후 3.6 mL 스크류 캡 cryotube로 옮깁니다.
2. 동결건조 튜브를 각 튜브에 0.5mL의 IP 결합 버퍼(표 1)로 헹굽니다. 샘플 손실을 최소화하기 위해 동일한 피펫 팁을 사용하여 용액을 3.6mL 스크류 캡 튜브로 옮깁니다. 헹굼을 1회 더 반복하여 최종 재현탁액을 2mL(단백질 5mg의 경우)로 만듭니다. 샘플 pH를 측정하여 약 7.4인지 확인합니다. 너무 산성인 경우 10μL의 1M Tris(적정되지 않음, pH ~11)를 반복적으로 첨가합니다. 너무 염기성인 경우 10μL의 묽은 HCl(1:25 또는 1:100)을 반복적으로 추가합니다.
3. pY 비드를 사전 세척합니다(시작 용해물 5mg의 경우).
   1. 샘플당 25μg의 4G10 항체와 12.5μg의 27B10.4 항체가 필요합니다. 절단 팁이 있는 p200 피펫을 사용하여 항체를 별도의 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 450μL의 얼음처럼 차가운 IP 결합 완충액 2x로 항체를 세척합니다. 100 x g에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.
   2. IP 결합 완충액을 사용하여 비드를 0.5mg/mL의 스톡 농도로 재현탁합니다. (구슬을 소용돌이치지 마십시오.) 필요한 슬러리(샘플당 50μL의 4G10 항체 슬러리 및 25μL 27B10.4 항체 슬러리)를 단일 튜브에 분취한 후 4°C에서 1분 동안 200 x g의 원심분리기 튜브를 회전시킵니다. 비드를 냉장고에 다시 보관하기 전에 상등액으로 측벽을 세척합니다.
4. 스크류 캡 cryotubes의 재현탁된 샘플 용액에 사전 세척된 pY 비드를 추가합니다. 4 °C에서 엔드 오버 엔드 로터에서 밤새 배양합니다.
5. 나사 캡 cryotubes를 섬세한 닦음이 깐 50mL 원심분리기 튜브에 넣습니다. 100 x g에서 1분 동안 구슬을 돌립니다. pST 펩타이드를 농축하는 데 사용될 상등액을 저장하십시오.
6. 300μL의 IP 결합 버퍼로 비드를 재현탁합니다. 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 4°C에서 1분 동안 100 x g의 속도로 스핀다운합니다.
7. 200μL의 IP 결합 완충액으로 배양 튜브를 3번 헹굽니다. 매번 동일한 마이크로 원심분리기 튜브에 내용물을 옮깁니다. 그런 다음 스핀 다운하십시오.
8. 마이크로 원심분리기 튜브의 비드를 500μL의 IP 결합 버퍼로 3번 세척하고 100 x g에서 1분 동안 스핀다운합니다. 그런 다음 비드를 450μL의 25mM NH₄HCO₃, pH 7.5로 4x 세척하고 100 x g에서 1분 동안 스핀다운합니다. 매번 분말에서 신선한 25mM NH₄HCO₃ 용액을 사용하십시오.
9. 1,500 x g에서 1분 동안 비드를 원심분리합니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 젤 로딩 팁의 팁을 비드 표면 약간 아래에 담궈 상층액을 완전히 제거합니다.
10. 비드에 0.1% TFA의 비드 부피의 4배를 추가합니다(즉, 75μg의 pY 비드 슬러리에 대해 0.1% TFA 300μL 추가). 잘 섞고 1,000rpm의 써모믹서에서 37°C에서 15분 동안 혼합물을 배양합니다.
11. 재현탁액을 0.2μm 스핀 필터로 옮깁니다. 용리 튜브를 빠르게 스핀다운하고 P10 파이펫을 사용하여 잔류 부피를 동일한 스핀 필터로 옮깁니다. 스핀 필터를 850 x g에서 1분 동안 스핀다운합니다. 용리액을 단백질 결합이 낮은 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 진공 농축액을 40 °C에서 밤새 건조시키고 300 분의 가열 시간으로 용리액을 건조시킵니다
    메모: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 샘플을 -80°C에서 동결하고 나중에 계속합니다.

표 1: 버퍼 및 솔루션.이 표는 이 프로토콜에 사용되는 버퍼 및 솔루션의 구성을 보여줍니다.

합니다. . 나트륨

완충기	음량	구성
6 M 구아니디늄 클로라이드 용해 완충액	50 밀리리터	6 M 구아니디늄 클로라이드, 100 mM 트리스 pH 8.5, 10 mM 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀, 40 mM 클로로아세트아미드, 2 mM 오르토바나데이트 나트륨, 2.5 mM 피로인산나트륨, 1 mM β-글리세로인산염, 500 mg n-옥틸-글리코시드, 초순수 부피
100mM 피로인산나트륨	50 밀리리터	2.23g 피로인산나트륨 12수화물, 초순수 부피
1M β-글리세로인산염	50 밀리리터	15.31g β-글리세로인산염, 초순수 부피
5% 트리플루오로아세트산	20 밀리리터	100% 트리플루오로아세트산 1mL를 19mL의 초순수에 첨가
0.1% 트리플루오로아세트산	250 밀리리터	5mL 5% 트리플루오로아세트산을 245mL 초순수에 첨가
pY 용리 완충액	250 밀리리터	0.1% 트리플루오로아세트산, 40% 아세토니트릴, 초순수 부피
pST 용리 완충액	250 밀리리터	0.1%trifluoroacetic 산, 50% 아세토니트릴, 부피에 ultra-pure 물
IP 바인딩 버퍼	200 밀리리터	50mM 트리스 pH 7.4, 50mM 염화나트륨, 초순수 부피
25mM 중탄산암모늄, pH 7.5	10 밀리리터	19.7 mg을 10 mL 멸균 초순수에 용해시키고 1 N 염산(~10-15 μL/10 ml 용액)으로 pH를 7.5로 하여 신선하게 만듭니다
1M 인산염 완충액, pH 7	1,000 밀리리터	423 mL 1 M 인산이수소나트륨, 577 mL 1 M 인산수소
평형 버퍼	14 밀리리터	6.3mL 아세토니트릴, 280μL 5% 트리플루오로아세트산, 1740μL 젖산, 5.68mL 초순수
헹굼 버퍼	20 밀리리터	9mL 아세토니트릴, 400μL 5% 트리플루오로아세트산, 10.6mL 초순수
질량 분석 솔루션	10 밀리리터	500μL 아세토니트릴, 200μL 5% 트리플루오로아세트산, 9.3mL 초순수
버퍼 A	250 밀리리터	5mM 인산일칼륨(pH 2.65), 30% 아세토니트릴, 5mM 염화칼륨, 초순수 부피
버퍼 B	250 밀리리터	5mM 인산일칼륨(pH 2.65), 30% 아세토니트릴, 350mM 염화칼륨, 초순수 부피
0.9% 수산화암모늄	10 밀리리터	300μL 29.42% 수산화암모늄, 9.7mL 초순수

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
동결건조기	랩콘코	7420020
CentriVap 탁상용 진공 농축기	랩콘코	7810010
킴와이프	피셔 사이언티픽	06-666ᅡ
Millipore 0.2 μm 스핀 필터	밀리포어 시그마	UFC30GVNB
단백질 결합이 낮은 Eppendorf 튜브	에펜도르프	22431081
안티 포스포티로신, 아가로스, 클론: 4G10	밀리포어 시그마	16101
27B10.4 항체	세포골격	APY03-비즈
펩타이드 분석 키트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	23275
탑팁	폴리엘씨 Inc	TT200TIO.96
SCX 컬럼(PolySULFOETHYL A)	폴리엘씨 Inc	SPESE1203
3 mL 주사기	BD (영어)	309657
MilliQ 워터			모든 용액과 완충액을 준비하는 데 사용되는 탈이온수
트리플루오아세트산(TFA)	피셔 사이언티픽	파이-28904
아세토니트릴(ACN)	피셔 사이언티픽	대답21-1
염화칼륨	피셔 사이언티픽	BP366-500
유산	시그마-알드리치	69785-250ML
수산화암모늄	피셔 사이언티픽	A669S-500
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-5

년 )