인산펩타이드 농축: 복합 펩타이드 혼합물에서 특정 인산화 펩타이드를 분리하는 항체 기반 면역침전 기법

이 논문에서

초록

이 비디오에서는 펩타이드 혼합물에서 포스호펩타이드의 항체 기반 면역침전을 보여줍니다. 농축된 인산펩타이드는 진공 농축되어 다운스트림 분석을 위해 보관됩니다.

프로토콜

1. pY 펩타이드의 면역침전 및 농축

정제된 펩타이드 분해물의 동결건조된 분말을 각 분획에 0.5mL의 얼음-저온 면역침전(IP) 결합 완충액으로 재현탁합니다. 0.5mL 재부유 부피를 두 번째 분획에서 첫 번째 분획으로 전달하여 분획을 풀링하고 피펫 팁을 저장합니다. (위아래로 피펫팅하는 대신) 격렬하게 와류를 일으켜 샘플이 완전히 용해되었는지 확인한 후 3.6 mL 스크류 캡 cryotube로 옮깁니다.
동결건조 튜브를 각 튜브에 0.5mL의 IP 결합 버퍼(표 1)로 헹굽니다. 샘플 손실을 최소화하기 위해 동일한 피펫 팁을 사용하여 용액을 3.6mL 스크류 캡 튜브로 옮깁니다. 헹굼을 1회 더 반복하여 최종 재현탁액을 2mL(단백질 5mg의 경우)로 만듭니다. 샘플 pH를 측정하여 약 7.4인지 확인합니다. 너무 산성인 경우 10μL의 1M Tris(적정되지 않음, pH ~11)를 반복적으로 첨가합니다. 너무 염기성인 경우 10μL의 묽은 HCl(1:25 또는 1:100)을 반복적으로 추가합니다.
pY 비드를 사전 세척합니다(시작 용해물 5mg의 경우).
1. 샘플당 25μg의 4G10 항체와 12.5μg의 27B10.4 항체가 필요합니다. 절단 팁이 ....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름	회사	카탈로그 번호	댓글
동결건조기	랩콘코	7420020
CentriVap 탁상용 진공 농축기	랩콘코	7810010
킴와이프	피셔 사이언티픽	06-666ᅡ
Millipore 0.2 μm 스핀 필터	밀리포어 시그마	UFC30GVNB
단백질 결합이 낮은 Eppendorf 튜브	에펜도르프	22431081
안티 포스포티로신, 아가로스, 클론: 4G10	밀리포어 시그마	16101
27B10.4 항체	세포골격	APY03-비즈
펩타이드 분석 키트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	23275
탑팁	폴리엘씨 Inc	TT200TIO.96
SCX 컬럼(PolySULFOETHYL A)	폴리엘씨 Inc	SPESE1203
3 mL 주사기	BD (영어)	309657
MilliQ 워터			모든 용액과 완충액을 준비하는 데 사용되는 탈이온수
트리플루오아세트산(TFA)	피셔 사이언티픽	파이-28904
아세토니트릴(ACN)	피셔 사이언티픽	대답21-1
염화칼륨	피셔 사이언티픽	BP366-500
유산	시그마-알드리치	69785-250ML
수산화암모늄	피셔 사이언티픽	A669S-500
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-5

년 )

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