인산펩티드의 이산화티타늄 기반 농축: 펩타이드 라이브러리에서 인산펩티드의 선택적 분리 방법

1. pY 펩티드의 이산화티타늄 농축

1. 건조된 인산펩타이드를 200μL의 50% ACN, 0.1% TFA에 재현탁시킵니다. 10,000 x g에서 30초 동안 소용돌이치고 원심분리합니다. 이 작업을 1번 반복하여 잘 다시 서스펜션합니다.
2. 200 μL 시료를 수용할 수 있는 팁에 포함된 TiO₂ 비드를 준비합니다.
   1. 팁의 작은 끝 쪽을 부드럽게 두드려 재료를 그 끝으로 이동합니다. 200μL의 100% ACN을 첨가하여 팁을 헹군 다음 팁을 뒤집고 작은 끝을 튕겨 액체를 캡 쪽으로 이동합니다.
   2. 면도날을 사용하여 끝의 작은 끝을 잘라 단백질 결합이 낮은 튜브 위에 놓습니다. (TiO₂가 튜브 측면에 달라붙으므로 폴리스티렌 튜브를 사용하지 마십시오.) 캡을 제거하고 마이크로피펫을 삽입하여 남아 있는 ACN을 빼냅니다. 200μL의 100% ACN으로 세척을 반복합니다. TiO₂ 비드는 이제 다음 단계를 위해 단백질 결합이 낮은 튜브에 위치합니다.
   3. 500μL의 100% ACN 2x로 TiO₂를 전처리합니다. 비드와 용매를 혼합하기 위해 피펫을 만듭니다. 100 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
   4. 조건 TiO₂, 0.2M 인산나트륨 완충액 500μL(pH ~7) 2x. 비드를 300μL의 평형 완충액 3x로 세척합니다. TiO₂는 밀도가 매우 높기 때문에 비드가 빨리 침전됩니다.
3. 400μL의 50% ACN, 0.1% TFA를 낮은 단백질 결합 튜브에 첨가한 다음 84μL의 젖산을 첨가합니다. 재현탁된 인산펩티드를 저단백질 결합 튜브로 옮기고 엔드-투-엔드(end-over-end) 회전자를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 비드를 100 x g에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿으로 만듭니다. 300μL의 평형 완충액(표 1)으로 2번 세척하고 100 x g에서 1분 동안 스핀다운합니다.
5. 300μL의 헹굼 버퍼로 비드를 2x로 헹굽니다.0.2μm 스핀 필터로 옮깁니다. 1,500 x g에서 1분 동안 돌립니다.
6. 필터 장치를 깨끗한 1.5mL 저단백질 결합 튜브로 옮깁니다. H₂O에서 0.9% NH₃ 200μL로 내용물을 2배 용리합니다. pH 스트립으로 pH를 측정하며, 이는 10에서 11 사이여야 합니다. 진공 농축액은 용리액을 밤새 건조시켜 암모니아를 증발시킵니다.

표 1: 버퍼 및 솔루션.이 표는 이 프로토콜에 사용되는 버퍼 및 솔루션의 구성을 보여줍니다.