인산펩티드의 이산화티타늄 기반 농축: 펩타이드 라이브러리에서 인산펩티드의 선택적 분리 방법

Abstract

출처: Cheng, L. C. et al. 전립선암의 인산단백질체를 조사하기 위한 무표지 정량 질량분석법과 결합된 인산펩타이드 농축. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 전립선 종양 조직에서 추출한 인산펩타이드의 이산화티타늄 기반 농축을 보여줍니다. 이러한 농축 인산펩타이드는 전립선암 진행과 관련된 세포 신호 경로를 이해하기 위한 단백질 특성화와 같은 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. pY 펩티드의 이산화티타늄 농축

1. 건조된 인산펩타이드를 200μL의 50% ACN, 0.1% TFA에 재현탁시킵니다. 10,000 x g에서 30초 동안 소용돌이치고 원심분리합니다. 이 작업을 1번 반복하여 잘 다시 서스펜션합니다.
2. 200 μL 시료를 수용할 수 있는 팁에 포함된 TiO₂ 비드를 준비합니다.
   1. 팁의 작은 끝 쪽을 부드럽게 두드려 재료를 그 끝으로 이동합니다. 200μL의 100% ACN을 첨가하여 팁을 헹군 다음 팁을 뒤집고 작은 끝을 튕겨 액체를 캡 쪽으로 이동합니다.
   2. 면도날을 사용하여 끝의 작은 끝을 잘라 단백질 결합이 낮은 튜브 위에 놓습니다. (TiO₂가 튜브 측면에 달라붙으므로 폴리스티렌 튜브를 사용하지 마십시오.) 캡을 제거하고 마이크로피펫을 삽입하여 남아 있는 ACN을 빼냅니다. 200μL의 100% ACN으로 세척을 반복합니다. TiO₂ 비드는 이제 다음 단계를 위해 단백질 결합이 낮은 튜브에 위치합니다.
   3. 500μL의 100% ACN 2x로 TiO₂를 전처리합니다. 비드와 용매를 혼합하기 위해 피펫을 만듭니다. 100 x g에서 1분 동안 원심분리합니다.
   4. 조건 TiO₂, 0.2M 인산나트륨 완충액 500μL(pH ~7) 2x. 비드를 300μL의 평형 완충액 3x로 세척합니다. TiO₂는 밀도가 매우 높기 때문에 비드가 빨리 침전됩니다.
3. 400μL의 50% ACN, 0.1% TFA를 낮은 단백질 결합 튜브에 첨가한 다음 84μL의 젖산을 첨가합니다. 재현탁된 인산펩티드를 저단백질 결합 튜브로 옮기고 엔드-투-엔드(end-over-end) 회전자를 사용하여 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 비드를 100 x g에서 1분 동안 원심분리하여 펠릿으로 만듭니다. 300μL의 평형 완충액(표 1)으로 2번 세척하고 100 x g에서 1분 동안 스핀다운합니다.
5. 300μL의 헹굼 버퍼로 비드를 2x로 헹굽니다.0.2μm 스핀 필터로 옮깁니다. 1,500 x g에서 1분 동안 돌립니다.
6. 필터 장치를 깨끗한 1.5mL 저단백질 결합 튜브로 옮깁니다. H₂O에서 0.9% NH₃ 200μL로 내용물을 2배 용리합니다. pH 스트립으로 pH를 측정하며, 이는 10에서 11 사이여야 합니다. 진공 농축액은 용리액을 밤새 건조시켜 암모니아를 증발시킵니다.

표 1: 버퍼 및 솔루션.이 표는 이 프로토콜에 사용되는 버퍼 및 솔루션의 구성을 보여줍니다.

합니다. . 나트륨

완충기	음량	구성
6 M guanidinium chloride 용해 완충액	50 밀리리터	6 M 구아니디늄 클로라이드, 100 mM 트리스 pH 8.5, 10 mM 트리스 (2-카르복시에틸) 포스핀, 40 mM 클로로아세트아미드, 2 mM 오르토바나데이트 나트륨, 2.5 mM 피로인산나트륨, 1 mM β-글리세로인산염, 500 mg n-옥틸-글리코시드, 초순수 부피
100 mM 피로인산나트륨	50 밀리리터	2.23g 피로인산나트륨 12수화물, 초순수 부피
1M β-글리세로인산염	50 밀리리터	15.31g β-글리세로인산염, 초순수 부피
5% 트리플루오로아세트산	20 밀리리터	100% 트리플루오로아세트산 1mL를 19mL의 초순수에 첨가
0.1% 트리플루오로아세트산	250 밀리리터	5mL 5% 트리플루오로아세트산을 245mL 초순수에 첨가
pY 용리 완충액	250 밀리리터	0.1% 트리플루오로아세트산, 40% 아세토니트릴, 초순수 부피
pST 용리 완충액	250 밀리리터	0.1% 트리플루오로아세트산, 50% 아세토니트릴, 초순수 부피
IP 바인딩 버퍼	200 밀리리터	50mM 트리스 pH 7.4, 50mM 염화나트륨, 초순수 부피
25mM 중탄산암모늄, pH 7.5	10 밀리리터	19.7 mg을 10 mL 멸균 초순수에 용해시키고 1 N 염산(~10-15 μL/10 ml 용액)으로 pH를 7.5로 하여 신선하게 만듭니다
1M 인산염 완충액, pH 7	1,000 밀리리터	423 mL 1 M 인산이수소나트륨, 577 mL 1 M 인산수소
평형 버퍼	14 밀리리터	6.3mL 아세토니트릴, 280μL 5% 트리플루오로아세트산, 1740μL 젖산, 5.68mL 초순수
헹굼 버퍼	20 밀리리터	9mL 아세토니트릴, 400μL 5% 트리플루오로아세트산, 10.6mL 초순수
질량 분석 솔루션	10 밀리리터	500μL 아세토니트릴, 200μL 5% 트리플루오로아세트산, 9.3mL 초순수
버퍼 A	250 밀리리터	5mM 인산일칼륨(pH 2.65), 30% 아세토니트릴, 5mM 염화칼륨, 초순수 부피
버퍼 B	250 밀리리터	5mM 인산일칼륨(pH 2.65), 30% 아세토니트릴, 350mM 염화칼륨, 초순수 부피
0.9% 수산화암모늄	10 밀리리터	300μL 29.42% 수산화암모늄, 9.7mL 초순수

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
진공 매니폴드	레스텍	26080
동결건조기	랩콘코	7420020
CentriVap 탁상용 진공 농축기	랩콘코	7810010
엔드 오버 엔드 로테이터	써모피셔 사이언티픽	415110Q (영문)
면도날	피셔 사이언티픽	620177
Amicon Ultra-15 원심 필터 장치	밀리포어 시그마	UFC901024
Nunc 15 mL 코니컬 튜브	써모피셔 사이언티픽	Tel.: 12-565-268
Millipore 0.2 μm 스핀 필터	밀리포어 시그마	UFC30GVNB
단백질 결합이 낮은 Eppendorf 튜브	에펜도르프	22431081
안티 포스포티로신, 아가로스, 클론: 4G10	밀리포어 시그마	16101
펩타이드 분석 키트	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	23275
트리플루오아세트산(TFA)	피셔 사이언티픽	파이-28904
아세토니트릴(ACN)	피셔 사이언티픽	대답21-1
유산	시그마-알드리치	69785-250ML
수산화암모늄	피셔 사이언티픽	A669S-500
인산칼륨 일염기성	피셔 사이언티픽	BP362-500
염화칼륨	피셔 사이언티픽	BP366-500
Calcium Chloride Dihydrate (염화칼슘 이수화물)	피셔 사이언티픽	BP510-500
트리스 베이스	피셔 사이언티픽	BP152-5
모노팁	폴리엘씨 Inc	TT200TIO.96