유전자 조작 마우스 모델의 전립선암 모델링: 마우스 전방 전립선 엽 세포에서 CRISPR/Cas9 매개 국소 유전자 편집 기술

Abstract

출처: Riedel, M. et al. 유전자 변형을 위해 쥐 전립선에 CRISPR 가이드의 바이러스 전달. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 아데노바이러스 기반 전달 시스템을 사용하여 전립선 세포의 특정 유전자를 편집하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 CRISPR 기술을 활용하여 유전자 발현의 정소성 및 국소적 변경을 가능하게 하여 전립선암에 대한 새로운 마우스 모델을 개발할 수 있습니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 쥐 전립선으로의 바이러스 전달

1. 멸균 1mL 주사기와 27G x 1/2" 바늘로 복강 내 주사로 동물을 마취합니다. 체중 0.01mL/g의 마취 용량을 사용합니다. 절차가 30분 이상 지속되는 경우 30분마다 시작 용량의 1/3을 주입하여 마취를 유지하십시오.
2. 근육 이완, 페달 철수 및 손바닥 반사를 평가하여 마취 깊이를 검사합니다. 반사 신경의 상실이 관찰되면 동물의 하복부를 면도하십시오.
3. 각막 반사 부족으로 인한 실명을 방지하기 위해 멸균 면봉을 사용하여 동물의 안과 연고로 동물의 눈을 조심스럽게 덮습니다.
4. 면도한 복부를 에탄올 70%와 포비돈 요오드 10%로 닦아 수술 부위를 소독합니다. 수술 부위 중앙에서 주변부로 수술 부위를 문지릅니다.
5. 멸균 수술용 가위를 사용하여 약 1cm의 하복부 정중선에서 수직 피부 절개를 수행합니다.
6. 미세한 점겸을 사용하여 복막을 들어 올려 아래에 있는 장기가 손상되지 않도록 합니다. 수술용 가위를 사용하여 복막을 통해 <8mm를 조심스럽게 절개합니다.
   참고: 인간과 달리 설치류의 전립선은 4개의 분리된 엽으로 구성되어 있습니다. 전엽(anterior lobe)은 정낭(seminal vesicle)에 부착되어 있습니다.
7. 지방 조직을 부드럽게 옆으로 움직여 정낭을 드러냅니다. 고리 겸자를 사용하여 전립선 전립선을 식별할 수 있을 때까지 정낭을 조심스럽게 들어 올립니다(그림 1).
8. 30G x 8mm 바늘이 있는 0.5mL 인슐린 주사기를 사용하여 전립선 상피에 총 부피의 30μL 바이러스(3 x 10¹⁰ 바이러스 입자) 용액을 주입합니다. 누출을 최소화하고 유체가 조직 내에서 흡수되어 작은 기포를 형성하도록 합니다. 정낭을 복강에 다시 놓습니다.
9. 13mm, 3/8 원 및 테이퍼 포인트 바늘이 있는 6-0 흡수성 봉합사를 사용하여 2-3개의 간단한 중단 스티치로 복막을 봉합합니다.
10. 3개의 멸균 4.8 x 6.5mm 클립으로 피부를 스테이플링하고 복막 손상을 방지하기 위해 집게로 피부를 들어 올립니다.
11. 더 나은 회복을 위해 멸균 1mL 주사기와 27G x 1/2" 바늘을 사용하여 복강 내 주사로 체중 0.01mL/g의 용량으로 마취 해독제를 바르십시오. 동물을 조심스럽게 우리에 다시 넣으십시오.

Results

그림 1: 절차 그림. 이 절차는 Platt 등에 의해 생성된 Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 마우스에서 수행됩니다. 전립선 전립선(AP)은 정낭(SV)에 부착되어 있습니다. 가이드 RNA와 Cre 단백질을 발현하는 바이러스 입자를 전립선 앞쪽에 주입하여 유전자 발현을 변경합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sor^{tm1(CAG-cas9*,-} ^{EGFP)Fezh} /J 마우스	잭슨 연구소	26175
0,5ml U-100 인슐린 주사기	BD (영어)	324825	바이러스 주입용
주사기 1ml	BD (영어)	300013	마취 주사용
30G 1/2'' 바늘	BD (영어)	304000	마취 주사용
6-0 다흡수 봉합사	메드트로닉	GL889	복막을 닫으려면
일회용 멸균 수술 드레이프	여러 공급업체
발열 패드	여러 공급업체
포비돈-요오드 준비 패드	피셔 사이언티픽	06-669-70
트리밍 기계	에스큘랍	GT415	복부를 면도하기 위해
Dumont 겸자	F.S.T	11252-00
Halsey 마이크로 니들 홀더	F.S.T	12500-12
아이리스 가위	F.S.T	14094-11
좁은 패턴 집게	F.S.T	11002-12
링 집게	F.S.T	11106-09
상처 클립 시스템 핸들 incl. 클립	F.S.T	12030-01	피부를 닫기 위해
상처 클립 시스템 리무버	F.S.T	12030-04
PBS 1개	지브코	제10010-023
안티세단			동물 시설에서 획득
부토르파놀			동물 시설에서 획득
메데토미딘하이드로클로라이드			동물 시설에서 획득
미다졸람			동물 시설에서 획득
100% 에탄올	피셔 사이언티픽	Tel.: 22-032-103
눈 연고	다케다	7242
바이러스(AAV, AV)	여러 공급업체		이 프로토콜에 사용된 바이러스는 자체 생산입니다.