게놈 DNA의 중아황산염 변환: 위장관 암 조직의 게놈 DNA 샘플에서 DNA 메틸화를 연구하는 방법

초록

출처: Bonetto, A. et al. 암 악액질 연구를 위한 모델로서의 결장-26 암종 종양 보유 마우스. J. Vis. 특급 (2016년)

이 비디오는 위장암 샘플에서 게놈 DNA의 중아황산염 변형 절차를 보여줍니다. 이 기술은 유전자의 메틸화 패턴 사이의 관계를 조사하고 발암에 대한 유전자의 기여도를 확립하는 데 유용합니다.

프로토콜

1. 중아황산염 처리

1. 45 μL의 분해된 조직 용액을 샘플로 사용합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 중아황산염 변환 키트의 시약을 사용하여 중아황산염 처리를 수행합니다(재료 표 참조).
   1. DNA 샘플에 5μL의 희석 완충액을 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다(재료 표 참조).
   2. 샘플이 배양되는 동안 CT 변환 시약 튜브 하나에 750μL의 dH₂O 및 210μL의 희석 완충액을 추가하여 중아황산염 전환 시약을 준비합니다(재료 표 참조). 10분 동안 볼텍싱하여 튜브를 혼합합니다.
   3. 15분 배양 후 준비된 CT 변환 시약 100μL를 각 샘플에 첨가하고 반전으로 혼합합니다.
   4. 50°C의 어두운 곳에서 12-16시간 동안 샘플을 배양합니다.
   5. 배양 후 샘플을 제거하고 10분 동안 얼음 위에 놓습니다.
   6. 400μL의 결합 완충액을 추가하고 위아래로 피펫팅하여 각 샘플을 혼합합니다(재료 표 참조). 각 샘플을 스핀 컬럼에 로드하고 컬럼을 2mL 수집 튜브에 넣습니다(재료 표 참조).
   7. 각 시료를 최대 속도(10,000 x g)로 1분 동안 원심분리하고 관류를 폐기합니다.
   8. 각 컬럼에 200μL의 세척 버퍼를 추가하고 1분 동안 최대 속도로 회전하여 플로우 스루를 버립니다(재료 표 참조).
   9. 각 컬럼에 200μL의 탈황 완충액을 추가하고 컬럼을 15분 동안 실온에서 방치합니다(재료 표 참조). 배양 후 1분 동안 최고 속도로 컬럼을 회전시키고 플로우스루를 버립니다.
   10. 각 컬럼에 200μL의 세척 버퍼를 추가하고 1분 동안 최고 속도로 회전합니다(재료 표 참조).
   11. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
   12. 각 컬럼에 46μL의 dH₂O를 추가하고 각 컬럼을 새로운 멸균 1.5mL 일회용 폴리프로필렌 튜브에 넣습니다(재료 표 참조). 각 튜브를 2분 동안 돌려 DNA를 용리시킵니다.
3. 일회용 폴리프로필렌 튜브에서 각 스핀 컬럼을 제거하고 폐기합니다(재료 표 참조). 이제 DNA를 분석할 준비가 되었습니다.

2. 정량적 메틸화 특이적 PCR(qMSP)

1. qMSP에서 1.3단계의 중아황산염 변형 DNA를 형광 기반 real-time PCR의 템플릿으로 사용하여 각 유전자 분석에서 promoter 영역의 메틸화를 평가합니다.
2. 96-well Real-Time PCR 기기를 사용하여 qMSP를 수행합니다(재료 표 참조).
   1. 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer 및 80 nM probe를 사용하여 bisulfite-modified DNA에서 타겟 유전자의 promoter methylation 상태를 확인합니다. 16.6 mM (NH₄)₂SO₄, 67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-메르캅토에탄올, 10 nM 플루오레세인, 각 0.166 mM의 각 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 및 0.04 U/μl의 DNA 중합효소로 마스터 믹스를 준비합니다(재료 표 참조). 모든 분석에 대한 각 웰의 최종 반응 부피는 25μL입니다.
   2. qMSP의 사이클링을 다음과 같이 수행합니다: 95°C에서 5분 동안 55°C, 95°C에서 15초, 60°C에서 1분, 72°C에서 1분 동안 55회 사이클을 수행합니다.
      참고: 타겟 유전자는 베타 값이 더 크고, 프로모터 영역의 CpG 섬과 관련이 있으며, qMSP의 프라이머 및 프로브 설계에 적합하다는 기준에 따라 선택해야 합니다.
3. CpG 메틸라아제(M.SssI)로 처리된 인간 게놈을 양성 메틸화 대조군으로 사용합니다(재료 표 참조).
   메모: 메틸화의 최종 정량화는 상대 메틸화 값(RMV)으로 정의되며 β-Actin(ACTB)에 대한 평균 Ct와 비교하여 각 메틸화 검출 반복에 대해 2^–ΔΔCt로 계산됩니다. 프라이머 및 프로브 염기서열은 표 1에 나와 있습니다. 검출되지 않은 반복에는 Ct 100이 사용되며, 이는 0에 가까운 2^–ΔΔCt 값을 제공합니다. 다음 수식이 사용됩니다.
   평균 2^–ΔΔCt (RMV) = (2^–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2^–ΔΔ Ct_replicate_3)/3.

유전자	전진 5' - 3'	리버스 5' - 3'	탐침
비액틴	태그 GGA GTA 탓 애그 TTG GGG AAG TT	AAC, ACA, CAA, TAA, CAA, CAA, CAA, ATT, CAC	\56-FAM\ TGT GGG GTG \ZEN\ GTG ATG 개그 GTT 태그 \3IABkFQ\
EPB41L3	GGG 아타 GTG GGG TTG ACG C	ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA	AAA, TTC, GAA, AAA, CCG, CGC, GAC, GAA, ACC

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(NH4)2SO4	시그마-알드리치	14148
10% 도데실황산나트륨(SDS)	351-032-721 EA
100% 에탄올	시그마-알드리치	24194
ABI StepOnePlus Real-Time PCR 시스템	어플라이드 바이오시스템즈	제4376600	96-well Real-Time PCR 기기
CT 변환 시약	자이모 리서치	D5001-1
디옥시뉴클레오티드 삼인산(dNTP)	인비트로젠	제10297-018
DEPC 처리수	DEPC 처리수	Tel.: 351-068-131
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)	코 닝	46-034-CL
EZ DNA 메틸화 키트	자이모 리서치	D5002
인간 게놈 DNA	뉴잉글랜드 바이오 연구소	N4002S
Infinium 인간 메틸화 450 분석	일루미나	WG-314	게놈에서 >450,000 CpG 부위의 메틸화 상태를 평가하기 위한 DNA 메틸화의 복잡한 평가를 위한 어레이 플랫폼
라이트 사이클러 480	로슈	5015278001
M-바인딩 버퍼	자이모 리서치	D5002-3
M-Desulphonation 완충액	자이모 리서치	D5002-5
M-희석 완충액	자이모 리서치	D5002-2
M-Wash 버퍼	자이모 리서치	D5002-4
프로테라제 K	뉴잉글랜드 바이오랩스	P8107S
일회용 폴리프로필렌(Eppendorf) 튜브	에펜도르프	24533495
트리스 염산염 (Tris-HCL) 2m pH 8.8	고품질 생물학	Tel.: 351-092-101
자이모 스핀 1 칼럼	자이모 리서치	C1003 (영문
β-메르캅토에탄올	시그마-알드리치	M3148
플루오레세인	바이오 라드	#1708780
Platinum Taq 중합효소	써모피셔 사이언티픽	제10966-034