유리화(Vitrification-based cryopreservation): 장기 보관을 위해 매우 낮은 온도에서 생물학적 시료를 보존하는 초고속 냉각 기술

초록

출처: Lu, J. H. et al. 위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오에서는 생물학적 시료를 보존하기 위한 초고속 극저온 유리화(cryo vitrification) 방법을 보여줍니다. 이 방법은 세포 내 얼음 결정 형성을 방지하여 생물학적 조직을 동결 손상으로부터 보호하기 위해 동결 보호제의 조합을 사용하는 것을 수반합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 조직 동결 보존

참고: 이 부분은 주로 Live Tissue Kit Cryo Kit의 방법을 참조합니다. 주요 키트 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 종양의 직경이 10mm보다 큰 경우 IRB 승인 방법으로 마우스를 안락사시킵니다.
2. 멸균 집게와 가위를 사용하여 쥐에서 종양을 천천히 분리하십시오.
3. 10cm 접시에 DPBS가 있는 종양 조직을 씻습니다. 집게와 가위로 괴사 부위, 지방 조직, 혈전 및 결합 조직을 절개하고 제거합니다.
4. 주형으로 종양 조직을 최대 1mm 두께로 자릅니다.
5. 10cm 접시에 DPBS로 조각을 씻으십시오.
   메모: 유리화(vitrification) 공정에는 1.6-1.8단계에서 V1/V2/V3로 표시된 튜브의 사용이 포함됩니다. 주성분은 DMSO와 자당입니다.
6. 집게를 사용하여 슬라이스를 튜브 V1에 옮기고 4°C에서 4분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브를 짧게 굴려 뒤집은 다음 4°C에서 4분 더 놓습니다.
7. V1 용액을 붓고 10cm 접시에 자릅니다. 집게를 사용하여 슬라이스를 튜브 V2로 옮기고 튜브 V2를 4°C에서 4분 동안 배양합니다. 튜브를 짧게 굴려 뒤집은 다음 4°C에 4분 더 놓습니다.
8. V2 용액을 붓고 10cm 접시에 자릅니다. 집게를 사용하여 슬라이스를 튜브 V3로 옮기고 4°C에서 5분 동안 튜브를 배양합니다. 튜브를 짧게 굴려 뒤집은 다음 4°C에서 최소 5분 동안 놓습니다. 조각이 모두 튜브 바닥으로 가라앉는지 확인하십시오.
   1. 여러 조각이 떠 있는 상태로 남아 있으면 튜브를 잠시 굴려 뒤집고 모든 조각이 완전히 가라앉을 때까지 튜브를 다시 4°C에 놓고 필요한 경우 떠 있는 조각을 버리십시오.
9. V3 용액을 붓고 10cm 접시에 자릅니다.
10. 티슈 홀더를 적절한 길이로 자르고 멸균 거즈에 올려 놓습니다. 슬라이스를 홀더에 옮깁니다. 홀더를 거즈로 감싸고 집게를 사용하여 액체 질소에 넣은 다음 5분 동안 배양합니다.
11. 극저온 바이알에 조직 정보를 표시합니다.
12. 조직 조각이 있는 홀더를 액체 질소에 저장된 극저온 바이알로 옮깁니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
라이브 티슈 키트, 크라이오 키트	Celliver Biotechnology, 상하이, 중국	LT2601
조직 가공 금형 및 보조 블레이드	Celliver Biotechnology, 상하이, 중국	LT2603
디피에스	Basalmedia Technology, 상하이, 중국	L40601