Peritoneal Low-density Neutrophil Isolation: A Technique to Obtain Low-density Neutrophils from Peritoneal Lavage Fluid Using Magnetic Activated Cell Sorting(복막 저밀도 호중구 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 복막 세척액에서 저밀도 호중구를 얻는 기술)

초록

출처: Kanamaru, R. et al. 복막 세척액에서 얻은 저밀도 호중구에 의해 생성된 호중구 세포 외 트랩은 종양 세포의 성장과 부착을 매개합니다. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 수술 후 인간 환자의 복막 세척액에서 저밀도 호중구(LDN)를 분리하는 절차를 설명합니다. 이렇게 얻은 LDN은 종양 성장 및 진행에 대한 LDN의 역할을 이해하기 위한 추가 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 복강 세척에서 LDN 분리

1. 샘플 수집
   1. 위장관 악성 종양으로 인해 복부 수술을 받은 환자의 상처 봉합 전에 정상 멸균 식염수 1,000mL를 복강에 직접 주입합니다.
      메모: 샘플은 연령이나 성별에 따른 편견 없이 위절제술, 결장 절제술 또는 식도 절제술을 받은 환자로부터 얻었습니다. 식염수를 용기에 옮겨 1분 이내에 복부 전체에 부었습니다. 이것은 환자에게 큰 영향을 미치지 않고 수술 후 복막 세척으로 일상적으로 수행됩니다.
   2. 최소 1분 동안 복강을 광범위하게 세척합니다.
      메모: 주입된 액체를 외과 의사의 손으로 천천히 저어 샘플이 균일하도록 하는 것이 좋습니다.
   3. 50mL 주사기 4개로 세척액 200mL를 회수합니다.
      메모: 때로는 고무 커넥터를 사용하여 유체를 흡수합니다.
2. 과립구 특이적 mAb, CD66b
   를 사용하여 복막 LDN의 정제를 수행합니다. 메모: 밀도 구배 원심분리 후 중간층에는 많은 단핵 세포가 포함되어 있기 때문에 CD66b mAb를 사용하여 다형체 호중구의 양성 선택을 수행했습니다.
   1. 복막 세척액을 50mL 튜브로 옮깁니다.
      메모: 이 단계에서는 100μm 나일론 필터에 유체를 통과시켜 불순물을 제거합니다.
   2. 복막액을 270 x g에서 상온에서 7분 동안 원심분리합니다.
   3. 0.02% EDTA로 5mL의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
   4. 5mL의 세포 현탁액을 3mL 밀도 구배 용액에 조심스럽게 오버레이합니다.
   5. 1,700 x g에서 원심분리기, 상온에서 15분간 쉬지 않고 원심분리기.
   6. 피펫을 사용하여 중간층(그림 1A)을 포함하는 용액을 약 2-3mL 동안 수확하고 0.02% EDTA가 함유된 PBS 10mL와 혼합합니다.
   7. RT에서 400 x g에서 7분 동안 복막액을 원심분리하고 상층액을 버립니다.
   8. 0.02% EDTA가 포함된 PBS 10mL를 더 추가하고 RT에서 7분 동안 270 x g에서 원심분리합니다. 상등액을 버립니다.
   9. 세포 펠릿(1 x 10⁷)을 자기 세포 분리 키트를 위해 60μL의 완충액에 용해시킵니다.
   10. 펠릿에 20μL의 Fc 블록을 추가하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.
   11. 마이크로비드와 접합된 anti-CD66b 20 μL를 첨가하고 4 °C에서 10분 더 배양합니다.
   12. 펠릿을 세척하고 500μL의 MACS 버퍼에 재현탁합니다.
   13. 적절한 자기 분리기의 자기장에 있는 자기 컬럼에 세포 현탁액을 적용하고 15mL의 완충액으로 컬럼을 세척하여 CD66b(-) 세포를 포함하는 관류를 수집합니다.
   14. 마그네틱 세퍼레이터에서 컬럼을 제거하고 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기 라벨이 부착된 CD66b(+) 셀을 즉시 씻어냅니다.
       메모: CD66b(+) 세포 집단은 FACS 분석에 의해 결정된 바와 같이 대부분 호중구로 구성되어 있으며, 이는 CD66(+) 분획의 >95%가 CD11b, CD15 및 CD16에 대해 양성이지만 CD14에 대해서는 음성임을 나타냅니다.

결과

그림 1: 복막 LDN 배양 후 NET 형성. (가)수술 후 세척액의 밀도 구배 원심분리 후, 중간층에서 회수된 세포를 나타낸다. (B) 그런 다음 CD66b(-) 단핵 세포에서 CD66b(+) LDN을 분리하고 폴리-L-라이신으로 코팅된 6웰 플레이트에서 배양한 후 핵 염색 염료를 첨가하고 형광 현미경으로 즉시 관찰했습니다. (C) 동일한 수의 CD66b(-) 단핵 세포를 동일한 조건에서 배양했습니다. (D) LDN 단층을 핵 염색 전 5분 동안 DNase I과 함께 배양하였다.(E) CD66b(+) LDN을 코팅하지 않고 플라스틱 플레이트에서 배양하였다. 흰색 막대는 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어, 스웨덴	Tel.: 17-1440-02
StraightFrom™ 전혈 CD66b 마이크로비즈	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-104-913
FC 블록	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-059-901
MACS 헹굼 솔루션	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-091-222
0.5mol/l-EDTA 용액 (pH 8.0)	Nacalai tesque, 일본	제06894-14
MACS BSA 재고 솔루션	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-091-376
LS 컬럼	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-041-306
MACS 자기 분리기	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-042-501

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