Peritoneal Low-density Neutrophil Isolation: A Technique to Obtain Low-density Neutrophils from Peritoneal Lavage Fluid Using Magnetic Activated Cell Sorting(복막 저밀도 호중구 분리: 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 복막 세척액에서 저밀도 호중구를 얻는 기술)

초록

출처: Kanamaru, R. et al. 복막 세척액에서 얻은 저밀도 호중구에 의해 생성된 호중구 세포 외 트랩은 종양 세포의 성장과 부착을 매개합니다. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 수술 후 인간 환자의 복막 세척액에서 저밀도 호중구(LDN)를 분리하는 절차를 설명합니다. 이렇게 얻은 LDN은 종양 성장 및 진행에 대한 LDN의 역할을 이해하기 위한 추가 다운스트림 실험에 사용할 수 있습니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 복강 세척에서 LDN 분리

1. 샘플 수집
   1. 위장관 악성 종양으로 인해 복부 수술을 받은 환자의 상처 봉합 전에 정상 멸균 식염수 1,000mL를 복강에 직접 주입합니다.
      메모: 샘플은 연령이나 성별에 따른 편견 없이 위절제술, 결장 절제술 또는 식도 절제술을 받은 환자로부터 얻었습니다. 식염수를 용기에 옮겨 1분 이내에 복부 전체에 부었습니다. 이것은 환자에게 큰 영향을 미치지 않고 수술 후 복막 세척으로 일상적으로 수행됩니다.
   2. 최소 1분 동안 복강을 광범위하게 세척합니다.
      메모: 주입된 액체를 외과 의사의 손으로 천천히 저어 샘플이 균일하도록 하는 것이 좋습니다.
   3. 50mL 주사기 4개로 세척액 200mL를 회수합니다.
      메모: 때로는 고무 커넥터를 사용하여 유체를 흡수합니다.
2. 과립구 특이적 mAb, C....

결과

그림 1: 복막 LDN 배양 후 NET 형성. (가)수술 후 세척액의 밀도 구배 원심분리 후, 중간층에서 회수된 세포를 나타낸다. (B) 그런 다음 CD66b(-) 단핵 세포에서 CD66b(+) LDN을 분리하고 폴리-L-라이신으로 코팅된 6웰 플레이트에서 배양한 후 핵 염색 염료를 첨가하고 형광 현미경으로 즉시 관찰했습니다. (C) 동일한 수의 CD66b(-) 단핵 세포를 동일한 조건에서 배양했습니다. (D) LDN 단층을 핵 염색 전 5분 동안 DNase I과 함께 배양하였다.(E) CD66b(+) LDN을 코팅하지 않고 플라스틱 플레이트에서 배양하였다. 흰색 막대는 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ficoll-Paque 플러스	GE 헬스케어, 스웨덴	Tel.: 17-1440-02
StraightFrom™ 전혈 CD66b 마이크로비즈	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-104-913
FC 블록	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-059-901
MACS 헹굼 솔루션	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-091-222
0.5mol/l-EDTA 용액 (pH 8.0)	Nacalai tesque, 일본	제06894-14
MACS BSA 재고 솔루션	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-091-376
LS 컬럼	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-041-306
MACS 자기 분리기	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, 독일	Tel.: 130-042-501

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