호중구 세포외 트랩 또는 NET의 형광 현미경: 암세포와 NET 간의 접착 상호 작용을 관찰하는 기술

초록

출처: Kanamaru, R. et al. 복막 세척액에서 얻은 저밀도 호중구에 의해 생성된 호중구 세포 외 트랩은 종양 세포의 성장과 부착을 매개합니다. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 호중구가 배출하는 세포 외 DNA 구성 요소인 호중구 세포 외 트랩(NET)의 형광 염색을 보여줍니다. 이 기술을 사용하면 암세포와 NET 간의 접착 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 적색 형광 세포 링커 염료를 사용한 종양 세포 염색

1. 인간 암 세포주 MKN45, NUGC 및 OCUM-1을 준비합니다.
2. 15mL 튜브에서 PBS + 0.02% EDTA로 1 x 10⁷ 세포를 세척하고 RT에서 7분 동안 270 x g에서 원심분리합니다.
3. 염료 염색을 위한 용액 1mL를 펠릿에 넣고 부드럽게 피펫팅합니다.
4. 염색을 위해 1mL의 용액에 4μL의 적색 형광 세포 링커 염료를 용해하고 1.2단계의 세포 현탁액과 혼합합니다.
5. RT에서 4분 동안 펠릿을 배양합니다.
6. DMEM 4mL(10% FBS)를 첨가하여 염색 반응을 중지합니다.
7. 270 x g을 7분 동안 원심분리기하고 상층액을 버립니다.
8. 1.6단계와 1.7단계를 두 번 반복합니다.
9. 형광 현미경(여기 = 551nm, 방출 = 567nm)으로 종양 세포가 빨간색으로 염색되었는지 확인합니다.

2. NET에 대한 종양 세포 부착 분석

1. 6-well poly-L-lysine 코팅 플레이트(직경 6cm)에서 5% CO₂로 37°C에서 2시간 동안 저밀도 호중구 세포를 배양하여 호중구 세포 외 트랩 또는 NET을 생산할 수 있습니다.
2. 0.1% BSA가 보충된 RPMI 1640 1mL에 적색 형광 염색 종양 세포(1 x 10,⁶)를 이식합니다.
3. NET을 생성한 LDN 배양에 종양 세포를 추가합니다.
4. 종양 세포가 NETs.
   와 접촉할 수 있도록 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 메모: 긴 배양은 종양 세포가 LDN 또는 플레이트에 부착되도록 유도합니다.
5. 매체를 제거하고 예열된 매체 2mL(0.1% BSA + RPMI 1640)를 넣고 접시를 휘젓아 웰을 부드럽게 씻습니다.
6. 2.5단계의 세탁 절차를 두 번 반복합니다.
   메모: 그물은 플레이트에 약하게 부착되기 때문에 그물 자체가 제거되지 않도록 가능한 한 부드럽게 세척해야 합니다.
7. NET의 시각화를 위해 핵과 염색체를 최종 농도 5μg/mL로 염색하기 위해 녹색 형광 염료를 추가합니다.
8. 적절한 필터(녹색, 여기 = 504nm, 방출 = 523nm, 빨간색, 여기 = 551nm, 방출 = 567nm)를 사용하여 NET과 부착된 종양 세포를 관찰합니다.
9. 그림을 병합하여 NETs.
   에 의해 갇힌 종양 세포를 표시합니다. 메모: 일부 실험에서는 LDN 배양액(최종 농도 100U/mL) 5분 전에 5분 동안 공동 배양하기 전에 DNA 분해 효소를 첨가했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SYTOX 녹색 핵산 염색 5mM 용액 DMSO	Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	S7020
PKH26 일반 세포막 라벨링을 위한 적색 형광 세포 링커 키트	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	P9691
RPMI1640 매체	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	R8758
소 혈청 알부민 동결 건조 분말, ≥96% (아가로즈 젤 전기영동)	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	A2153
폴리-L-라이신 코팅 MICROPLATE 6Well	이와키, 일본	4810-040
플루오레세인 실체현미경	BX8000, Keyence, 오사카 일본	BZ-X710
MKN45 인간 위암 세포주	Riken, Tukuba 일본	해당 사항 없음
NUGC-4 인간 위암 세포주	Riken, Tukuba 일본	해당 사항 없음
OCUM-1 인간 위암 세포주	일본 오사카 시립 대학교	해당 사항 없음	M. Yashiro 박사의 선물
DNase I	워딩턴, 레이크우드 뉴저지	LS002138
0.5 mol/l-EDTA 용액 (pH 8.0)	Nacalai tesque, 일본	제06894-14
Dulbecco's Modified Eagle 중고 포도당(DMEM)	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	D5796