호중구 세포 외 트랩 또는 NET의 타임 랩스 형광 현미경 검사: 암세포와 NET 간의 접착 후 상호 작용을 분석하는 기술

초록

출처: Kanamaru, R. et al. 복막 세척액에서 얻은 저밀도 호중구에 의해 생성된 호중구 세포 외 트랩은 종양 세포의 성장과 부착을 매개합니다. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오에서는 저밀도 호중구와 위암 세포를 공동 배양하여 호중구 세포외 트랩(NET)에 갇힌 암세포의 접착 후 거동을 분석합니다. 타임 랩스 비디오 분석은 다양한 세포 이벤트를 모니터링하고 병리학적 조건에서 NET의 역할을 연구하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 갇힌 종양 세포의 타임 랩스 비디오 분석

1. 폴리-L-라이신으로 코팅된 35mm 원형 접시에 복막 LDN을 배양하고 5% CO₂에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
2. 핵과 염색체를 염색하기 위해 녹색 형광 염료를 추가하여 최종 농도인 5μM에서 NET을 시각화합니다.
3. 배양 1분 후 배지를 제거하고 0.1% BSA + RPMI 1640 2mL를 추가합니다.
4. 배지를 제거하고 0.1% BSA + RPMI 1640에 현탁된 염색되지 않은 1 x 10⁶ MKN45 셀을 추가합니다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
5. 예열 매체 2mL(0.1% BSA + RPMI 1640)를 넣고 접시를 휘젓는 방식으로 접시를 부드럽게 씻어 부착되지 않은 종양 세포를 제거합니다.
6. 위의 세탁 절차를 두 번 반복합니다.
   메모: 그물은 플레이트에 약하게 부착되기 때문에 그물 자체가 제거되지 않도록 가능한 한 부드럽게 세척해야 합니다.
7. 100 u/mL 페니실린과 100 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 10% FCS가 포함된 DMEM을 추가합니다.
8. 전체 보기 세포 관찰 시스템에 배양 접시를 장착하고 종양 세포가 NET에 의해 포획되는 적절한 필드를 선택합니다.
9. 추가로 이틀 동안 공동 배양을 계속하고 MKN45 세포와 NET을 각각 감지하는 일반 조명과 형광 아래에서 6분마다 현장의 연속 사진을 촬영합니다.
10. 각 시점에서 이미지를 겹쳐놓고 이미지 뷰어 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 비디오를 구성합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SYTOX 녹색 핵산 염색 5mM 용액 DMSO	Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	S7020
RPMI1640 미디엄	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	R8758
Dulbecco's Modified Eagle 중고 포도당(DMEM)	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	D5796
Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	D8537
소 태아 혈청, 적격, USDA 승인 지역	GIBCO by Life Technologies, 멕시코	10437-028
소 세럼 알부민 동결건조 분말, ≥96% (아가로즈 젤 전기영동)	Sigma-Aldrich, 세인트루이스, 미주리, 미국	A2153
페니실린 스트렙토마이신	라이프 테크놀로지스 재팬	15140-122
플라즈모신 예방	InvivoGen, 미국 캘리포니아주 샌디에이고,	개미-MPP
플루오레세인 실체현미경	BX8000, Keyence, 오사카 일본	BZ-X710
전체 보기 세포 관찰 시스템	Nikon, Kanagawa, 일본	바이오스튜디오(BS-M10)
MKN45 인간 위암 세포주	Riken, Tukuba 일본	해당 사항 없음

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