엑소좀 블록 준비: 배양된 인간 대장암 세포의 엑소좀을 보존하기 위한 프로토콜

초록

출처: Jung, M. K. et al. 투과 전자 현미경에 의한 엑소좀의 샘플 준비 및 이미징. J. Vis. 특급 (2018년)

이 동영상은 배양된 위장관 종양 세포에서 엑소좀 블록을 제조하는 기술에 대해 설명합니다. 이러한 엑소좀 블록은 추가로 절단, 염색 및 이미징하여 지질 이중층 소포체에서 특정 단백질의 위치를 결정할 수 있습니다.

프로토콜

1. 엑소좀의 블록 준비

1. HCT116 세포의 배양 상등액에서 엑소좀을 100,000 x g에서 1.5시간 동안 원심분리하여 펠렛화합니다. 배양 상등액을 제거하고 정제된 엑소좀 펠렛을 2.5% 글루타르알데히드 1mL를 0.1M 카코딜산나트륨 용액(pH 7.0)에 넣고 4°C에서 1시간 동안 조심스럽게 고정합니다.0.1M 카코딜산나트륨의 경우, 4.28g의 카코딜산을 160mL의 증류수(DW)에 용해시킵니다. 0.1M HCl로 pH를 7.4로 조정한 다음 증류수로 최대 200mL를 만듭니다.
2. 고정제를 제거하고 실온에서 1mL의 0.1M 카코딜산나트륨 완충액으로 펠릿을 헹굽니다. 세 번 반복하고 변경할 때마다 10분 동안 지속됩니다.
3. 4°C에서 1시간 동안 1mL의 2% 사산화오스뮴으로 샘플을 사후 고정합니다.
4. 정착제를 제거하고 10분마다 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액으로 3회 헹굽니다.
5. 쉐이커에서 등급이 매겨진 아세톤 계열(각각 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%)로 10분 동안 배양합니다.
6. 아세톤을 제거하고 3 : 1 아세톤 용액을 배양합니다 : 저점도 임베딩 혼합물을 30 분 동안 배양합니다. 엑소좀 펠릿은 튜브 안에 있습니다.
7. 매체를 제거하고 1 : 1 아세톤 : 저점도 임베딩 혼합물 배지를 첨가 한 다음 30 분 동안 배양합니다.
8. 매체를 제거하고 1 : 3 아세톤 : 저점도 임베딩 혼합물 배지를 첨가 한 다음 30 분 동안 배양합니다.
9. 매체를 제거하고 100% 저점도 임베딩 혼합물을 첨가하고 실온에서 밤새 배양합니다.
10. 임베딩 몰드를 사용하여 순수한 저점도 임베딩 혼합물에 시료를 삽입하고 65°C에서 24시간 동안 베이킹합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
글루타르알데히드	EMS (엠에스)	16200
카코딜산나트륨	EMS (엠에스)	12,300
오스뮴 테트록사이드 1g 결정	EMS (엠에스)	19100	흄 후드에서만 사용
아세톤	준세이	AN-번호 1B2031

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