Gold Immunostaining of Exosomal Sections: A Technique to Visualize Diagnostic Markers in Exosomal Lumen(엑소좀 절편의 금 면역염색: 엑소좀 루멘에서 진단 마커를 시각화하는 기술)

초록

출처: Jung, M. K., Mun, J. Y. 투과 전자 현미경을 통한 엑소좀의 샘플 준비 및 이미징. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오에서는 초박형 엑소좀 절편의 내강 영역 내에 국한된 바이오마커의 금 면역 염색을 보여줍니다. 이 기술은 질병에 걸린 세포가 분비하는 엑소좀 내 표적 분자를 시각화하여 질병을 조기에 진단할 수 있도록 합니다.

프로토콜

1. 엑소좀 절편 및 이미징의 면역 염색

1. 초극권자를 사용하여 엑소좀 블록의 60nm 초박막 절편을 준비하고 니켈 그리드에 수집합니다.
2. 0.02M 글리신 50μL 방울로 그리드를 10분 동안 배양하여 유리 알데히드 그룹을 소멸시킵니다.
3. 100 μL의 DW를 10분 동안 각각 3회 헹굽니다. 1% BSA를 함유한 PBS에서 1시간 동안 실온에서 배양합니다.
4. 항-KRS 항체 50-100 μL 방울(0.1% BSA를 함유한 PBS에서 1:100)을 1시간 동안 그리드를 배양합니다(필요한 경우 이 단계를 4°C에서 밤새 수행해야 함).
5. 0.1% BSA가 함유된 PBS를 각각 10분 동안 5방울(50μL)로 떨어뜨려 그리드를 세척합니다.
6. 그리드를 1시간 동안 2차 항체 방울로 옮깁니다(0.1% BSA를 함유한 PBS에서 10nm 금 입자(1:100)에 접합된 항토끼 IgG).
7. 매 10분마다 0.1% BSA가 함유된 PBS 5방울(50μL)로 그리드를 세척합니다.
8. 어두운 조건에서 20분 동안 2% 우라닐 아세테이트로 이중 염색하고 Reynold의 시트르산납으로 10분 동안 각각 이중 염색합니다.
9. 80kV에서 투과 전자 현미경으로 그리드를 관찰합니다.
10. "Acquire"를 클릭한 다음 80kV의 TEM 아래에 있는 CCD 카메라 시스템에서 "File" 및 "Save as"를 클릭합니다. 노출 시간은 자동 설정을 따랐습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
우라닐 아세테이트	EMS (엠에스)	22400	유해 화학 물질
구연산납	EMS (엠에스)	17900
투과 전자 현미경	히타치	H7600
구리 그리드	EMS (엠에스)	G200-CU
글리신	시그마	022K5404
인산염 완충액 식염수	시그마	P4417
소 혈청 알부민	오리온	25557
정제된 항인간 CD274 (B7- H1, PD-L1) 항체	바이오레전드	329710	전체 마운트 Immumogold
정제 마우스 IgG2b, κ Isotype Ctrl	바이오레전드	401202	전체 마운트 Immumogold (Control)
2차 안티 마우스 IgG 접합 9-11nm 금 입자	시그마	G7652 (영문
파라포름알데히드	EMS (엠에스)	19210