Negative staining of Purified Exosomes: A Procedure to Visualize Exosome Morphology Using Transmission Electron Microscopy(정제된 엑소좀의 음성 염색: 투과전자현미경을 이용한 엑소좀 형태 시각화 절차)

초록

출처: Jung, M. K. et al. 투과 전자 현미경을 통한 엑소좀의 샘플 준비 및 이미징. J. Vis. Exp. (2018)

이 동영상은 정제된 엑소좀의 음성 염색 절차를 설명합니다. 음성으로 염색된 엑소좀은 투과전자현미경(Transmission Electron Microscopy)을 사용하여 이미지화합니다. 이 기술은 엑소좀의 형태를 시각화하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 네거티브 염색

1. 글로우 배출기로 얇은 formvar/carbon 필름 코팅된 200 메쉬 구리 EM 그리드를 1분 동안 글로우 방전합니다.
2. 정제된 엑소좀을 1mL의 2% 파라포름알데히드(PFA)로 5분 동안 고정합니다.
   참고: 파라포름알데히드 연기는 독성이 있습니다. 모든 작업은 환기가 잘 되는 흄 후드에서 수행해야 합니다.
3. 그리드에 5-7μL 엑소좀 현탁액을 로드하고 1분 동안 배양합니다. 엑소좀의 농도가 너무 높으면 농도를 1/2에서 1/5로 희석합니다.
4. 주사기로 EM 그리드 표면에 여과된 1% 우라닐 아세테이트(UA) 용액 ~20방울로 즉시 염색합니다.
5. 그리드 가장자리를 여과지와 접촉하여 그리드에서 과도한 UA 솔루션을 제거합니다.
6. 물 한 방울로 그리드를 빠르게 헹굽니다. 이 단계는 과도한 염색 용액을 제거합니다.
7. 핀셋으로 그리드를 잡고 테이블 위에 놓고, 배양 접시로 그리드를 부분적으로 덮어 실온에서 10분 동안 건조시킵니다.
8. 80kV에서 TEM으로 나중에 관찰할 수 있도록 EM 그리드 상자에 그리드를 저장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
우라닐 아세테이트	EMS (엠에스)	22400	유해 화학 물질
투과 전자 현미경	일본 전자(JEOL)	JEM2200FS
글로우 방전기	일본 전자(JEOL)	JFC1100E
파라포름알데히드	EMS (엠에스)	19210
Formvar 탄소 코팅 구리 그리드(200메시)	EMS (엠에스)	FCF200-CU
Formvar 탄소 코팅 니켈 그리드(200메시)	EMS (엠에스)	FCF200-NI