절편을 위한 근육 조직의 스냅 동결: 급속 동결된 쥐 근육 조직의 초박형 절편을 얻기 위한 프로토콜

초록

출처: Bonetto, A. et al. 암 악액질 연구를 위한 모델로서의 결장-26 암종 종양 보유 마우스. J. Vis. 특급. (2016년)

이 비디오는 근육 조직을 스냅 동결하고 얇은 부분을 얻는 절차를 설명합니다. 이 기술은 대장암 마우스 모델에서 암 관련 악액질을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 근육 동결 및 장착

1. 이소펜탄이 들어있는 작은 플라스틱 비커(50mL)의 아래쪽 절반을 액체 질소에 담급니다. 이소 펜탄은 약간 점성이 생기고 비커 내부를 감싸는 단단한 흰색 라미네이트를 형성하면 사용할 준비가됩니다 (온도 : -160 ° C) .
   메모: 항상 스파크가 발생하지 않는 청동 또는 알루미늄 수공구를 사용하십시오. 제품 증기를 흡입하지 마십시오. 적절한 환기와 함께 사용하십시오. 유출 및 환기에 대처하는 것이 불가능하거나 실용적이지 않은 경우 적절한 호흡기를 착용하십시오.
2. 척(코르크)에 있는 일부 임베딩 매체를 이소펜탄에 짧게(10초) 담궈 동결합니다.
3. 근육(예: 경골 또는 비복근)을 코르크에 수직으로 상대로 힘줄을 잡고 섬유의 방향을 유지하고 단면을 허용하여 근육을 처리합니다.
4. 신선한 근육의 끝 부분을 냉동 임베딩 매체 위에 조심스럽게 놓습니다.
   메모: 근육이 달라붙을 것입니다. 임베딩 배지로 근육을 완전히 둘러싸지 않는 것이 중요합니다. 단면적의 후속 결정을 위해 수직 방향을 유지하는 것도 중요합니다.
5. 근육이 부착된 척을 이소펜탄 수조에 담그십시오(일반적인 동결 시간은 표본 크기 및 구성에 따라 7-15초입니다).
   메모: 냉동 용액에 담그는 것은 표본을 완전히 동결하는 데 필요한 것보다 오래 지속되어서는 안 됩니다. 너무 오래 얼면 조직 블록이 파괴되고 너무 짧으면 얼음 결정이 형성됩니다. 잘 얼린 표본은 백악질의 흰색입니다.
6. 검체를 동결한 후 작은 비닐 봉지나 검체 튜브(50mL)에 넣고 즉시 -80°C의 급속 냉동고 또는 액체 질소에 보관하십시오.

2. 근육 절편

1. 저온 유지 장치 내부 챔버의 작동 온도를 약 -23 °C로 설정합니다.
2. 시편(이전에 -80°C에서 보관)이 작동 온도에 순응하도록 합니다(몇 시간이면 충분함).
3. 표본의 8μm 두께의 절편(가급적 경골 전방 근육 또는 비복근)을 여러 개 잘라 유리 슬라이드에 수집합니다.
   메모: 근육의 배 중간 부분을 자릅니다.또한 정확성을 위해 장착 축에 수직으로 부분을 자릅니다.
4. 유리 슬라이드를 저온 유지 장치 챔버 내부에 보관하십시오. IF/IHC 연구 또는 효소 염색을 수행하는 것이 목적인 경우 해동하지 마십시오.
5. 추가 분석을 위해 슬라이드를 -80°C에서 보관하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10월	티슈텍	4583
저온 유지 장치	라이카	CM1850
코르크 디스크	전자 현미경 과학	63305
Superfrost plus 유리 슬라이드	폭스바겐	제48311-703