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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 표 1에 기술된 바와 같이, 콜론 완충액, 실리카 기반 밀도 분리 매체 100%, 실리카 기반 밀도 분리 매체 66%, 실리카 기반 밀도 분리 매체 44%, 콜라겐분해효소 E 분해 완충액 및 FACS 완충액을 제조합니다.
- 시술 전날 Colon Buffer를 준비하고 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
- 시술 전날 100% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 준비하고 4°C에서 밤새 보관하고 시술 당일 아침에 실온에서 해동합니다.
- 분리 당일 아침에 실온 100% 실리카 기반 밀도 분리 매체와 결장 완충액을 사용하여 66% 및 44% 실리카 기반 분리 매체를 준비합니다.
- 클로스트리듐 히스톨리티컴 유래 콜라겐분해효소 E의 적정량을 측정하고 시술 전 -20°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 다음 날 아침, 적절한 양의 Colon Buffer에 용해시켜 Collagenase Digestion Buffer를 추출합니다. 시술 당일 Collagenase Digestion Buffer를 사용한 모든 배양의 경우 용액을 37°C로 예열합니다.
- 전체 프로토콜 단계에서 원심분리기 1개를 20°C, 회전 속도 859 x g로 유지하고, 그래디언트 원심분리를 위해 브레이크를 비활성화(0 감속)합니다. 세척 단계를 위해 다른 하나를 4°C로 설정하고 회전 속도를 859 x g로 설정하고 표준 감속을 사용합니다.
2. 결장 채취
- CO2 질식 후 AALAC 승인 확인 방법을 통해 마우스를 안락사시킵니다.
- 마우스를 누운 자세로 놓고 털에 70% 에탄올을 뿌립니다. 큰 티슈 가위를 사용하여 수직 정중선을 절개하여 손상되지 않은 복막을 노출시킵니다.
- 미세한 해부 가위를 사용하여 복막을 엽니다. 집게를 사용하여 소장을 한쪽으로 움직이고 하강하는 결장을 노출시킵니다. 결장의 직장 부분을 최대한 노출시키기 위해 하행 결장을 위쪽으로 약간 당깁니다. 골반 깊숙이 원위 직장을 절개하고 원위 직장에서 두골 캡까지 결장 전체를 하나의 단위로 절개하고 제거합니다.
- 50mL 폴리프로필렌 튜브에 20mL 냉각 대장 완충액을 넣어 결장을 옮깁니다.
3. 결장 세척
- 물에 적신 종이 타월 위에 결장을 놓고 가위나 집게의 뭉툭한 끝으로 대장을 가볍게 눌러 단단한 대변을 추출합니다.
- 페트리 접시에 결장을 넣고 18G 뭉툭한 충전 바늘이 있는 10mL 주사기를 사용하여 10mL의 차가운 결장 완충액으로 장을 씻어냅니다.
- 결장을 Colon Buffer에 적신 종이 타월로 옮기고 가위의 날카로운 끝으로 장간막과 지방을 제거합니다.
- 5-10mL의 식힌 대장 완충액으로 채워진 페트리 접시에 결장을 넣고 수동으로 교반하여 남아 있는 대장 내용물을 씻어냅니다. 2-3회 반복합니다.
- 신선하고 차가운 Colon Buffer로 채워진 Petri 접시에서 더 근육질의 직장 끝에서 근위 결장까지 결장을 세로로 절단합니다(하나의 직사각형 열린 결장 조각 생성). 기존 미디어를 버리고 깨끗하고 냉각된 Colon Buffer로 다시 채웁니다.
- 페트리 접시에서 장을 세게 휘젓고 세척할 때마다 5-10mL의 식힌 대장 완충액을 교체하여 장을 3회 세척합니다.
- 대장 완충액을 적신 종이 타월에 직사각형 결장 조직을 놓고 가로로 자른 다음 작은 조각(3mm x 3mm 절편)으로 자릅니다.
- 50mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 담긴 20mL 냉각 대장 완충액에 미세한 집게를 사용하여 결장 단편을 조심스럽게 수집합니다.
- 결장 단편을 30초 동안 격렬하게 소용돌이쳐 20mL 결장 완충액으로 세 번 세척합니다. 각 교반 사이에 조직 조각이 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 디캔트 또는 진공 흡입은 각 세척 사이의 흡인 과정에서 조직 단편 손실을 방지하면서 상층액을 흡인합니다.
메모: 세탁 후에는 튜브를 교체할 필요가 없습니다.
4. 콜라겐분해효소 분해 1
- 20mL의 콜라겐분해효소 분해 완충액을 50mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브의 세척된 결장 절편에 추가합니다.
- 닫힌 50 mL 튜브를 37 °C의 인큐베이션된 오비탈 쉐이커에 넣고 회전 속도를 2 x g으로 설정하여 60분 동안 교반하는 동안 조직 단편이 계속 움직이는지 확인합니다. 필요한 경우 조직 단편이 튜브 바닥에 가라앉지 않도록 회전 속도를 점진적으로 높입니다.
5. 실리카 기반 분리 매체 그라디언트 준비
- 20°C(실온)에서 100% 실리카 기반 밀도 분리 매체와 결장 완충액을 사용하여 66% 및 44% 실리카 기반 밀도 분리 매체를 준비합니다.
- 66% 실리카 기반 밀도 분리 매체 5mL를 3개의 개별 15mL 폴리프로필렌 튜브 각각에 붓습니다. 결장당 3개의 튜브를 준비합니다. 이것은 gradient isolation 절차의 더 높은 밀도 베이스를 형성하며, 그 위에 더 낮은 밀도의 분리 매체가 층을 이루어 분리 gradient를 생성합니다.
- 사용할 때까지 20 °C에서 보관하십시오.
6. Digestion 1에서 상등액의 수집
- Collagenase Digestion 1이 완료된 후 25mL 혈청학적 피펫을 사용하여 상등액만 수집하고 깨끗한 50mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 넣은 40μm 공극 여과 패브릭 셀 스트레이너를 통해 상등액을 여과합니다. 기존 조직 조각을 흡인하지 않도록 주의하십시오.
알림: 튜브에 남아 있는 보이는 조직 조각을 보관하십시오. 이들은 두 번째 콜라겐분해효소 분해를 거칩니다(8단계).
7. 담금질 콜라겐 분해 효소 분해 완충액
- 50mL 폴리프로필렌 튜브에 냉각된 콜론 버퍼를 완전히 채웁니다.
메모: 콜라겐 분해 효소는 37 °C에서 활성화됩니다. 따라서 냉각된 완충액은 이 효소를 비활성화합니다.
- 4°C에서 800 x g에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.
- 진공 흡입을 통해 상등액을 폐기합니다. 25mL의 새로운 Colon Buffer와 800 x g의 원심분리기로 5분 동안 세포를 세척합니다.
- 펠릿을 1mL 미만의 신선하고 냉각된 Colon Buffer에 재현탁시킵니다.
- 50mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
8. 콜라겐분해효소 소화 2
- 6.1단계에서 유지된 나머지 조직 조각으로 4단계(분해 1)를 반복합니다.
9. 소화 후 조직 분해 2
- 18G의 뭉툭한 바늘을 통해 튜브와 10mL 주사기 사이를 앞뒤로 세게 조직 조각을 세게 씻어냅니다.
- 최소 7-8번의 완전한 통로에 대해 이 세척을 반복하고 전체적인 조직 조각이나 파편이 보이지 않을 때까지 계속합니다.
10. 셀 필터링
- 조직 분해 현탁액을 40μm 공극 여과 패브릭 세포 여과기를 통해 깨끗한 50mL 폴리프로필렌 튜브에 통과시킵니다.
- 여과 패브릭 세포 여과기를 10mL 냉각 콜론 버퍼로 세척하여 필터에 걸린 세포를 회수합니다.
11. 콜라겐 분해 효소 담금질
- 50mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브를 냉각된 Colon Buffer.
로 가장자리까지 채웁니다.
참고: Colon Buffer의 온도는 콜라겐분해효소 활성의 담금질을 보장하는 데 중요합니다.
- 4°C, 800 x g에서 5분 동안 회전합니다.
- 진공 흡입을 통해 상등액을 폐기합니다.
- 25mL의 신선하고 차가운 Colon Buffer에 재현탁하여 세척한 다음 4°C, 800 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
- 진공 흡입을 통해 상등액을 폐기합니다.
- Collagenase Digestion 1(7단계)에서 재현탁된 펠릿을 11.4단계의 해당 튜브에 풀링합니다.
- 11.4단계(세척 및 원심분리)를 반복합니다.
12. 실리카 기반 밀도 분리 매체 구배 분리
참고: 콜라겐분해효소 활성의 빠른 담금질을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 12-13단계를 수행하십시오.
- 11.7단계에 따라 결장당 총 44% 실리카 기반 밀도 분리 매체 24mL에 각 펠릿을 재현탁합니다.
- 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 12.1단계의 배지 8mL를 5.2단계에서 준비한 3개의 튜브(66% 실리카 기반 밀도 분리 매체 포함) 각각에 천천히 층을 이룹니다. 44% 밀도 분리 매체(Density Separation Media)의 안정적이고 느린 흐름을 유지하면서 계면의 중단을 방지하기 위해 그래디언트를 계층화합니다.
- 계량 저울 또는 저울을 사용하여 원심분리기 버킷 내의 모든 튜브의 균형을 조심스럽게 조정합니다.
- 20°C에서 브레이크 없는 원심분리기에서 859 x g로 20분 동안 튜브를 돌립니다. 튜브를 제거하기 전에 로터가 완전히 정지할 때까지 하고 기울기 계면에서 세포를 방해하지 않도록 주의하십시오.
13. 그래디언트 인터페이스(Gradient Interface)에서 단핵 세포 수집
- 일반적으로 1-2mm 두께의 흰색 띠(MNC 포함)가 존재하는 그래디언트 계면(5mL 마크 근처)을 시각화합니다.
메모: 흰색 띠를 볼 수도 있고 못할 수도 있습니다. 그러나 MNC는 이 인터페이스에 있으며 그라디언트 인터페이스의 선명도를 흐리게 해야 합니다.
- 진공 흡입하고 상단 그래디언트의 상단 7mL를 폐기하여 파이펫이 계면에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
- 지속적인 수동 흡입과 꾸준한 회전 손목 동작을 사용하여 세포의 계면층을 깨끗한 50mL 폴리프로필렌 원추형 튜브에 수집합니다. 두 gradient 사이의 계면이 명확하고 굴절성(세포 제거)이 될 때까지 수집합니다.
- 수집 튜브에 50mL의 냉각 FACS 버퍼를 채웁니다. 4 °C, 800 x g에서 5 분 동안 회전합니다.
- 진공 흡입을 통해 상층액을 흡입하고 1mL의 FACS Buffer에 펠릿을 재현탁합니다.
- 적절한 dead cell exclusion 방법을 사용하여 1:2 희석으로 혈구계에서 세포를 계수합니다.
- 새로 분리된 결장 MNC를 사용하여 FACS 염색 또는 기타 분석을 진행합니다.
표 1: 솔루션 준비 테이블
| 용액 | 식 |
| 결장 완충액 | 500mL RPMI + 10mM HEPES + 10% FBS(56°C에서 60분 동안 열 비활성화, pH 7.3으로 조정) |
| 실리카 기반 밀도 구배 매체 100%(콜론당) | 22.5mL의 실리카 기반 밀도 구배 매체 + 2.5mL의 10x PBS. |
| 실리카 기반 밀도 구배 매체 66%(콜론당) | 10.72mL 실리카 기반 밀도 구배 매체 100% + 5.28mL 콜론 완충액 |
| 실리카 기반 밀도 구배 매체 44%(결장당) | 11mL 실리카 기반 밀도 구배 매체 100% + 14mL 결장 완충액 |
| Collagenase Digestion Buffer (결장당) | 40mL 결장 완충액에 용해된 Clostridium histolyticum의 콜라겐분해효소 E 100U/mL |
| FACS 버퍼 | 500mL 1x PBS + BSA 5g + EDTA 1mm + 아지드화 나트륨 0.2g |