출처: Teal, E. et al. 재생 연구를 위한 마우스 및 인간 유래 1차 위 상피 단층 배양. J. Vis. 특급 (2018년)
이 비디오는 인간의 기저 조직에서 위 상피 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 분리된 상피 세포는 위 생리학 및 병태 생리학에서 조절 역할을 연구하기 위한 체외 모델로 사용할 수 있습니다.
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방법 논문
위 안저 땀샘 격리 : 인간의 위 조직에서 기저 땀샘을 분리하는 방법
2.9K 조회수
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2023년 4월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.
1. 인간 유래 3D 위 기저 오가노이드 구축
참고: 오염을 방지하려면 멸균 조직 배양 후드 내에서 프로토콜 전체를 수행하십시오. 위소매절제술을 받은 환자로부터 인간 기저조직을 채취했습니다.
- 위소매절제술을 받은 환자의 조직을 채취하여 큰 플라스틱 용기에 담아 얼음처럼 차가운 Ca2+/Mg2+-free Dulbecco's Phosphate Buffered Saline(DPBS)에 넣습니다.
- 겸자를 사용하여 100mL Ca2+/Mg2+-free DPBS가 들어있는 멸균 비이커에서 조직을 세게 씻습니다. 약 30초 동안 또는 파편과 혈액이 제거될 때까지 세척하십시오. 그런 다음 멸균 거즈를 사용하여 상피의 점막층을 닦아냅니다.
- 큰 집게를 사용하여 조직의 근육층을 단단히 잡고 큰 구부러진 지혈 겸자를 사용하여 힘으로 상피를 긁어냅니다. 긁어낸 상피 조각을 멸균된 폴리스티렌 페트리 접시에 모읍니다.
- 조직 소화를 최적화하기 위해 면도기를 사용하여 상피 조직을 약 2.0 x 2.0mm2 크기의 조각으로 다집니다. 항생제(Ca2+/Mg2+ -free DPBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.25 mg/mL 암포테리신 B/10 mg/mL 겐타마이신, 50 mg/mL 카나마이신)가 첨가된 Ca2+/Mg2+ -free DBPS로 조직 조각을 세척합니다. 필요한 경우 여러 번 세탁하십시오. 멸균 거즈를 통해 세척물을 폐기물 비커에 조심스럽게 걸러내어 세척물을 버리십시오.
- 세척된 단편을 25mm 교반 막대와 예열된 배양 배지(2mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 10mM HEPES 완충액, 1mg/mL 콜라겐분해효소 유형 1, 2mg/mL 세포 배양 등급 소 혈청 알부민이 보충된 기저 배지)가 있는 125mL 유리 둥근 바닥 플라스크에 수집합니다. 둥근 바닥 플라스크를 고무 격막으로 밀봉합니다.
- 20G의 척추 바늘을 격막에 삽입하고 고무 호스로 산소 탱크에 연결합니다. 오염 물질을 걸러내려면 티슈 페이퍼를 튜브에 삽입하여 필터를 만듭니다. 산소 유출을 낮게 켭니다. 격막의 파열을 방지하기 위해 10-15개의 유출 바늘을 격막에 삽입합니다.
- cl을 사용하여 설정을 링 스탠드에 고정합니다.amps 및 37-30분 동안 교반 플레이트를 사용하여 45°C로 보정된 수조에 놓습니다. 조직을 15분 동안 배양한 후 50μL의 배양 배지를 제거하고 해리된 땀샘을 육안으로 확인합니다. 땀샘이 조밀하지 않거나 조직에서 분리되지 않은 경우 5-10분 더 그대로 두십시오.
- 배양 직후, 멸균 혈청학 피펫을 사용하거나 배양 혼합물에 직접 주입하여 예열된 50mL의 DMEM/F-12를 배양 배지에 추가합니다.
- 멸균 거즈를 통해 글랜드 혼합물을 4개의 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다. 추출된 땀샘이 원뿔형 튜브의 바닥에 가라앉을 수 있도록 여과액을 얼음 위에 15분 동안 유지합니다. 침전된 땀샘을 방해하지 않도록 주의하십시오. 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액 상단 40mL를 제거하고 폐기합니다. 항생제를 보충한 DPBS 10mL에 나머지 10mL를 재현탁합니다.
- 혼합물을 5mL 세포 배양 시험관에 고르게 분배합니다. 4°C에서 65 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
메모: 얼음 위에서 이 단계를 수행하고 혼합하는 동안 기저막 매트릭스의 중합을 피하는 것이 중요합니다. 또한 50μL를 샘플링하여 글랜드 밀도를 육안으로 검사하는 것이 중요합니다. 최적의 밀도는 ~70% 포화도입니다. - 다음으로, 끝이 넓은 피펫을 사용하여 기저막 매트릭스의 50μL에 땀샘을 플레이트링합니다. 도금하는 동안 기포가 생성되지 않도록 하십시오.
- 기저막 매트릭스가 중합될 수 있도록 37°C에서 10-15분 동안 배양합니다. 12웰 배양 플레이트에 도금하는 경우 hFGO 배지 1mL(2mM L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.25mg/mL 암포테리신 B/10mg/mL 겐타마이신, 50mg/mL 카나마이신, 10mM HEPES 완충액, 1mM n-악테일시스틴, 1 x N2, 1 x B27, 웰당 100ng/mL 뼈 형태 유전 단백질 억제제, 1nM 가스트린, 50ng/mL 표피 성장 인자, 200ng/mL 섬유아세포 성장 인자 10, 10mM 니코틴아미드 및 10μM Y-27632 ROCK 억제제)가 보충된 50% Wnt-조건 배지, 20% R-스폰딘 조건 배지. 12웰 배양 플레이트를 사용하지 않는 경우 기저막 매트릭스 기포가 잠길 수 있을 만큼 충분한 매체를 추가합니다.
- 5%CO2 가습 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양합니다. 4-5일마다 미디어를 교체하십시오.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ca2+/Mg2+ - 무 DPBS | 어부 | 21-031CV | |
| 멸균 거즈 | |||
| 곡선형 지혈 겸자 | |||
| 멸균 페트리 접시 | |||
| 멸균 면도날 | |||
| Advanced Dulbecco's Modified Eagle/F12 medium (기초 배지) | 생명 기술 | 제12634-010 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 써모 사이언티픽(Thermo Scientific | SV30010 | |
| 암포테리신 B/겐타마이신 | 써모 사이언티픽(Thermo Scientific | R01510 | |
| 글루타맥스(L-글루타민) | 생명 기술 | 제25030-081 | |
| 카나마이신 | 써모 피셔 | 로1510 | |
| 콜라겐분해효소 유형 1 | 워 딩 턴 | LS004214 | |
| 소 세럼 알부민 | 시그마 알드리치 | A9418 | |
| HEPES 버퍼 | 시그마 알드리치 | H0887 | |
| 125 mL 둥근 바닥 플라스크 | |||
| 1인치(25mm) 교반 막대 | |||
| 고무 격막 | |||
| 3.5인치 길이의 척추 바늘 20G | 써모 피셔 | 405182 | |
| Kimwipes (티슈 페이퍼) | 피셔 사이언티픽 | 06-666씨 | |
| 고무 호스가 있는 산소 탱크 | |||
| 링 스탠드 클램프 | |||
| 37 °C 수조 | |||
| 5 mL 세포 배양 시험관 | 어부 | 14-956-3씨 |
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