Intestinal Crypts Isolation: A Method to Isolate Whole Crypts from Small Intestine of Murine 모델

초록

출처: Schewe, M. et al. 장 줄기 및 틈새 세포의 기능 분석을 위한 오가노이드 재구성 분석(ORA). J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오에서는 마우스의 소장에서 전체 소변선을 분리하는 기술을 보여줍니다. 분리된 전체 crypt는 수명이 길고 자가 재생되는 3D 오가노이드를 in vitro에서 증식시키는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 악기, 배양 배지 및 요리 준비

1. 멸균 용기에 장 가위, 일반 가위 및 집게 한 세트를 오토클레이브합니다.
2. 96웰(바닥이 평평한) 접시를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
3. 재료 표에 나열된 시약으로 10mL의 완전한 배양 배지를 준비합니다.
4. 전체 배지를 37°C의 수조에서 배양합니다.
5. 해동된 지하실 멤브레인을 얼음 양동이에 넣어 재구성했습니다. 재구성된 기저막은 4°C에서 액체가 됩니다.
6. 4개의 페트리 접시에 차가운 인산염 완충 식염수 또는 PBS(4°C)를 채웁니다.

2. 소장샘의 격리

1. C57BL6/J 배경에 Lgr5-eGFP-IRES-CreER^t2 마우스를 CO 2 흡입으로 희생합니다. 가위로 복막을 세로로 절개합니다.
2. 집게로 배를 잡고 가로로 반으로 자릅니다.
3. 지금부터 장 가위를 사용하여 장을 빼내고 PBS.
   가 들어있는 페트리 접시에 넣습니다. 메모: 장 가위는 끝이 날카롭고 뭉툭합니다. 이 가위의 뭉툭한 끝은 장을 여는 동안 crypt-villus 구조를 손상시키지 않기 위한 것입니다.
4. 먼저 뭉툭한 끝을 배에 넣고 유문을 통해 부드럽게 밀어 넣습니다. 가위로 자르고 집게로 잡아당겨 진행합니다.
5. 소장 전체가 세로로 열리면 집게로 잡고 차가운 PBS로 씻고 PBS 용액에 U자 모양으로 부드럽게 헹굽니다.
6. 대변 찌꺼기가 모두 제거되면 내강이 위로 향하게 하여 도마에서 장을 평평하게 만듭니다. 발광 쪽은 혈관이 없고 바깥쪽과 비교할 때 창백한 모양으로 쉽게 알아볼 수 있습니다.
7. 유리 슬라이드로 납작한 장을 긁어 융모를 부드럽게 제거합니다. 조직의 전체 길이를 따라 이 단계를 두 번 수행합니다.
8. 멸균 수술 용 칼날로 소장을 2-5mm 조각으로 자릅니다.
9. 얼음처럼 차가운 PBS 10mL가 들어 있는 50mL 튜브에 소장 조각을 넣습니다.
10. 조직 조각을 세척하고 PBS에서 위아래로 피펫팅하여 남아 있는 불순물을 제거합니다. 상층액을 버리고 PBS가 완전히 투명해질 때까지 이 단계를 반복합니다.
11. 15mL의 차가운 PBS를 추가하여 PBS의 총 최종 부피를 25mL로 만듭니다. 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 넣고 4°C의 롤러에서 45분 동안 배양합니다.
12. PBS/EDTA를 폐기합니다.
13. PBS 10mL를 추가하고 조직 조각을 위아래로(최소 3회) 거칠게 피펫팅하여 crypt를 분리합니다. 상층액을 수집합니다.
14. 2.13단계를 네 번 반복합니다. 최종 부피 50mL에 도달하도록 배양 배지를 추가합니다.
15. 원심분리(300 x g에서 5분 동안)로 세포를 펠렛화합니다.
16. 펠렛을 10mL의 배양 배지에 재현탁시키고 원심분리(3분 동안 80 x g)로 crypt를 펠렛
화합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고급 DMEM/F-12	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	제12634-010
페니실린/스트렙토마이신	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15140122	최종 농도 : 1 %
글루타맥스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	35050061	최종 농도: 10mM
헤페스	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	15630080	최종 농도: 10mM
재조합 쥐 EGF	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	PMG8041	최종 농도: 50ng/ml
재조합 쥐 Noggin	페프로텍	250-38	최종 농도 : 100 ng / ml
y27632	시그마	Y0503	최종 농도: 10μM
들쭉날쭉한-1	Anaspec 바이오	AS-61298	최종 농도: 1μM
재조합 쥐 R-spondin	R&D 시스템	제3474-RS-050	최종 농도 : 1 mg / ml
B6.129P2-Lgr5tm1(크레인/ERT2)클레/J	잭슨 연구소	8875
낮은 바인딩 튜브	에펜도르프	Z666548-250개

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