출처: Prasad, M. et al. 아데노 관련 바이러스-Cas9 시스템을 사용하여 유전자 조작된 쥐 두경부암 세포주의 체외 구축. J. Vis. 특급 (2020년)
이 비디오에서는 쥐의 혀에서 상피 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 세포는 세포 콜로니를 발생시키기 위해 추가로 배양될 수 있습니다.
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방법 논문
쥐 혀 상피 세포의 분리 및 배양: 마우스 모델에서 혀 상피 세포를 분리하고 배양하는 절차
3.9K 조회수
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2023년 4월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 일차 세포의 분리 및 배양
- 6주 된 수컷 또는 암컷 B6를 안락사시킵니다. 129-GT(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)CO₂ 질식 또는 기타 IACUC 승인 프로토콜에 의한 Fezh/J.
메모: 이 CRISPR/Cas9 knockin 마우스는 CAG promoter에 의해 지시된 cas9 endonuclease 및 EGFP의 Cre 재조합효소 의존성 발현을 가지고 있습니다. 이 마우스의 게놈에 존재하는 업스트림 Lox-Stop-Lox(LSL) 서열은 Cre 재조합효소가 없을 때 Cas9 및 EGFP의 발현을 방지합니다. 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 Cre 소스와 함께 사용하면 in vivo 또는 ex vivo에서 단일 또는 다중 마우스 유전자를 편집할 수 있습니다. - 수술용 가위를 사용하여 안락사된 쥐의 혀를 절개합니다.
- 메스를 사용하여 혀 조직을 매우 작은 조각으로 다져 조직을 수동으로 해리합니다. 4.5mL의 RPMI 일반 배지(혈청 제외)가 들어 있는 15mL 튜브에 조직 조각을 수집합니다.
- 삼중 효소 혼합물(200μL)(레시피는 표 1 참조)을 조직 절편에 추가합니다.
- 조직-효소 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양하고 10분마다 튜브를 두드려 조직의 효소 해리를 향상시킵니다.
- HBSS/PBS를 함유한 5% 소 태아 혈청(FBS)을 조직-효소 혼합물에 첨가하여 효소 작용을 중지합니다.
- 멸균된 70μm 나일론 메쉬를 통해 위의 세포 현탁액을 여과하여 분산된 세포와 더 큰 조직 조각을 분리합니다.
- RT에서 HBSS/PBS에서 300 x g의 원심분리로 여과된 세포 현탁액을 5분 동안 세척합니다.
- 펠릿을 배양 배지(RPMI/DMEM에서 10% FBS)에 재현탁하고 뚜렷한 세포 콜로니가 형성될 때까지 60mm 배양 접시에서 성장합니다.
- 배양 세포 응집체는 세포 콜로니가 형성될 때까지 3mL의 완전한 배지(RPMI/DMEM에서 10% FBS)를 포함하는 60mm 배양 접시의 필터 상단에 유지됩니다.
- 배양 1주일 후 섬유아세포 오염의 존재 여부에 대해 일차 세포를 현미경으로 검사합니다. 응집체와 세포 현탁액에서 발생한 일차 세포를 37°C에서 1분 동안 0.25 트립신 0.02% EDTA 용액으로 처리하여 섬유아세포를 제거합니다.
메모: 일반적으로 세포 응집체의 1차 배양은 단일 세포 현탁액에 비해 더 많은 콜로니를 생성합니다. 이러한 콜로니의 세포는 AAV 형질도입으로 더 나은 형질도입 효율을 제공합니다.
| 10X 트리플 효소 스톡 솔루션: | |
| 콜라겐 분해 효소 | 최종 농도 1g [10mg/mL] |
| 히알루로니다아제 | 100 mg[1 mg/mL] |
| DNase | 20,000 단위 최종 농도 [200 mg/mL] |
| PBS 1배 | 최대 100mL까지 만들 수 |
표 1: 이 연구에 사용된 완충액의 제조법
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마우스 균주 | |||
| C57BL/6 | 엔비고 | ||
| 나6; 129-GT(ROSA):26Sortm1(CAGcas9*,-EGFP)페즈/J | 잭슨 연구소 | 24857 | |
| 끄덕이다. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid) | 엔비고 | ||
| 효소 | |||
| 벤조나아제 | 시그마 | 1014회 | |
| 콜라겐분해효소 IV | 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| DNA제 | 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific | 18047019 | |
| 히알루로니다아제 | 밀리포어시그마 | H3506 | |
| 트립신 | 생물 산업 이스라엘 BeitHaemek Ltd. | 03-050-1B | |
| 배양 배지, 화학 물질 및 시약 | |||
| 증권 시세 | 암레스코 | 0332 - 탐 - 50G | |
| DMEM을 참조하십시오. | 생물 산업 이스라엘 BeitHaemek Ltd. | 01-055-1ᄀ | |
| FBS(증권 시세 | 생물 산업 이스라엘 BeitHaemek Ltd. | 04-127-1ᄀ | |
| HBSS (하이브에스) | 시그마 | H6648 | |
| PBS (PBS) | 생물 산업 이스라엘 BeitHaemek Ltd. | 02-023-1ᄀ | |
| 트리스 버퍼 | MERCK 밀리포어 | 648311-1KG | |
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| 팔콘 튜브 | Greiner 바이오 원 |
