RNA CISH를 위한 FFPE 조직 전처리: RNA 발색 현장 혼성화를 위한 포르말린 고정 파라핀 내장 조직 절편을 처리하는 절차

초록

출처: Outh-Gauer, S. et al. HPV 관련 두경부암 진단을 위한 도구로서의 발색성 현장 혼성화. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 RNA 발색 현장 혼성화를 위한 FFPE 조직 표본의 전처리와 관련된 단계를 보여줍니다. 전처리 과정은 세포 내의 핵산 무결성과 전체 조직 형태를 유지하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 재료 준비

1. 1x 타겟 회수 시약의 준비
   1. 큰 비커에 630mL의 증류수에 70mL의 10x 표적 회수 시약(재료 표 참조)을 추가합니다.
   2. 자기 교반기가 있는 가열판에 비커를 놓습니다. 알루미늄 호일로 덮으십시오.
   3. 내용물을 100°C에서 10-15분 동안 끓입니다.
      알림: 30분 이상 끓이지 마십시오.

2. 조직 전처리

참고: 이 단계는 두경부 샘플에 대한 제조업체의 지침에 따른 "표준" 전처리 권장 사항을 따릅니다. 섹션 2.1 및 2.2의 타이밍은 조작된 조직에 따라 조정해야 할 수 있습니다.

1. 과산화효소 활성의 봉쇄
   1. 각 슬라이드에 과산화수소 4-6방울(재료 표 참조)을 추가하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
   2. 슬라이드를 실온의 증류수로 2분 동안 2회 세척합니다.
2. RNA/조직 경계의 파손
   1. 가열판에 놓인 끓는 1x 표적 회수 시약(TTR1x)에서 알루미늄 호일을 집게발로 제거하고 교반을 멈춥니다. 슬라이드 랙을 15분 동안 천천히 그리고 매우 조심스럽게 담그십시오. 비커를 알루미늄 호일로 다시 덮습니다.
      메모: 이 단계 중에도 시머링이 지속되어야 합니다.
      주의: 발톱을 사용하여 알루미늄 호일과 슬라이드 랙을 조작하여 화상을 입지 않도록 하십시오. 장갑과 실험복과 같은 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   2. 발톱을 사용하여 즉시 핫 슬라이드 랙을 증류수 수조로 옮기고 2분 동안 세척합니다.
      메모: 샘플이 TTR1x에서 냉각되지 않는지 확인하십시오.
   3. 슬라이드를 신선한 100% 에탄올로 2분 동안 세척합니다.
   4. 슬라이드를 실온에서 2분 동안 건조시킵니다.
3. 장벽 생성
   1. 소수성 배리어 펜(재료 표 참조)을 사용하여 샘플 주위에 배리어를 그립니다. 최소 5분 동안 건조시키십시오.
      메모: 장벽이 실제로 건조되도록 하십시오. 시술 중에 마모 된 경우 주저하지 말고 다시 당기십시오. 펜으로 티슈를 만지지 마십시오. 프로토콜은 여기에서 하룻밤 동안 일시 중지할 수 있습니다.
4. 프로테아제 소화
   1. 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 샘플당 Protease Plus를 ~4방울 떨어뜨립니다(재료 표 참조).
   2. 습도 조절 트레이를 뚜껑으로 덮고 30°C에서 40분 동안 혼성화 오븐에 삽입합니다.
      메모: 증발을 방지하려면 회전 손잡이가 잠금 위치로 완전히 돌려져 있는지 확인하십시오.
   3. 오븐에서 트레이를 제거하고 슬라이드 랙을 제거합니다.
   4. 한 번에 하나의 슬라이드로 여분의 액체를 빠르게 제거하고 증류수로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓습니다.
   5. 슬라이드를 실온의 증류수로 2분 동안 2회 세척합니다. 끊임없이 동요하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HybEZ 오븐 (110v)	어드밴스드 셀 진단 Inc.	321710
HybEZ 슬라이드 랙	어드밴스드 셀 진단 Inc.	300104
ImmEdge 소수성 배리어 펜	어드밴스드 셀 진단 Inc.	310018
RNAscope H202 & Protease Plus 시약	어드밴스드 셀 진단 Inc.	322330	수소 과산화수소 x2 및 프로테아제 플러스 x 1
RNAscope 타겟 회수 시약	어드밴스드 셀 진단 Inc.	322000