RNA In Situ Hybridization에서 프로브 혼성화 및 신호 증폭: 조직 절편에서 특정 RNA 염기서열을 검출하는 기법

초록

출처: Outh-Gauer, S. et al. HPV 관련 두경부암 진단을 위한 도구로서의 발색성 현장 혼성화. J. Vis. 특급 (2019년)

이 동영상은 mRNA 프로브를 특정 타겟 mRNA에 하이브리드화하는 것과 관련된 순차적 하이브리드화 전략을 설명합니다. 프로브 하이브리드화 후, 조직학적 샘플의 RNA-CISH 동안 신호 대 잡음비의 감소를 통해 분해능을 향상시키기 위해 신호 증폭이 수행됩니다.

프로토콜

인간 참가자와 관련된 모든 절차는 인간 복지를 위한 기관, 국내 및 국제 지침에 따라 수행되었으며 지역 기관 검토 위원회의 검토를 거쳤습니다.

1. 분석 실행

참고: 배양 단계 사이에 섹션이 건조되지 않도록 하십시오.

1. HPV 프로브의 혼성화
   알림: 사용하기 전에 침전물을 용해시키기 위해 프로브가 예열되었는지 확인하십시오. 이 단계에서는 HPV 프로브 대신 양성 대조군을 위한 펩티딜-프롤릴 이소머라제 B(PPIB) 또는 음성 대조군을 위한 디하이드로디피콜리네이트 환원효소(DAPB)를 사용할 수도 있습니다(재료 표 참조).
   1. 슬라이드를 두드리거나 튕겨 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 넣습니다. 각 섹션을 완전히 덮기 위해 HPV 프로브를 ~4방울 떨어뜨립니다.
   2. 트레이를 뚜껑으로 덮고 2°C에서 40시간 동안 오븐에 넣습니다.
      알림: 증발을 방지하려면 회전 손잡이가 잠금 위치로 완전히 설정되어 있는지 확인하십시오.
   3. 오븐에서 트레이를 제거하고 슬라이드 랙을 제거합니다.
   4. 한 번에 하나의 슬라이드로 여분의 액체를 빠르게 제거하고 1x 세척 버퍼로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓습니다.
   5. 슬라이드를 1x 세척 버퍼에 넣고 실온에서 2분 동안 계속 교반하면서 세척합니다. 신선한 1x 세척 버퍼로 이 작업을 반복합니다.
2. AMP1, AMP2, AMP3 및 AMP4
   의 하이브리드화 알림: 이 단계에는 혼성화 오븐의 혼성화가 포함되며 구입한 키트의 AMP1–AMP4(재료표 참조).
   1. 탭 및/또는 튕겨 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 놓습니다. AMP1 ~4방울을 넣어 각 섹션을 완전히 덮습니다.
   2. 트레이를 뚜껑으로 덮고 40°C에서 30분 동안 오븐에 넣습니다.
   3. 오븐에서 트레이를 제거하고 슬라이드 랙을 제거합니다.
   4. 한 번에 하나의 슬라이드로 여분의 액체를 빠르게 제거하고 1x 세척 버퍼로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓습니다.
   5. 슬라이드를 1x 세척 버퍼에 넣고 실온에서 2분 동안 계속 교반하면서 세척합니다. 신선한 1x 세척 버퍼로 이 작업을 반복합니다.
   6. 1.2.1–1.2.5단계를 반복하되 AMP1 대신 AMP2 ~4방울을 사용하고 40°C에서 15분 동안 배양합니다. 신선한 세척 버퍼에서 두 번 모두 2분 동안 슬라이드를 2번 세척합니다.
   7. 1.2.1–1.2.5단계를 반복하되 AMP1 대신 AMP3 ~4방울을 사용하고 40°C에서 30분 동안 배양합니다. 신선한 세척 버퍼에서 두 번 모두 2분 동안 슬라이드를 2번 세척합니다.
   8. 1.2.1–1.2.5 단계를 반복하되 AMP1 대신 AMP4 ~4방울을 사용하고 40°C에서 15분 동안 배양합니다. 새 세척 버퍼에서 두 번 모두 2분 동안 슬라이드를 2회 세척합니다.
3. AMP5 및 AMP6
   의 하이브리드화 알림: 이 단계에는 오븐에서의 혼성화가 포함되지 않고 실온에서의 혼성화가 포함됩니다. AMP5 및 AMP6은 구입한 키트에서 제공됩니다(재료표 참조).
   1. 슬라이드를 두드리거나 튕겨 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 넣습니다. AMP5 ~4방울을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다.
   2. 트레이를 뚜껑으로 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
   3. 한 번에 하나의 슬라이드로 여분의 액체를 빠르게 제거하고 1x 세척 버퍼로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 넣습니다.
   4. 슬라이드를 1x 세척 버퍼에 넣고 실온에서 2분 동안 계속 교반하면서 세척합니다. 신선한 1x 세척 버퍼로 이 작업을 반복합니다.
   5. 1.3.1–1.3.4단계를 반복하되 AMP5 대신 AMP6 ~4방울을 사용하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.슬라이드를 2분 동안 2회 세척하며, 두 번 모두 새 세척 버퍼에서
   세척합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
HybEZ 오븐 (110v)	어드밴스드 셀 진단 Inc.	321710
HybEZ 슬라이드 랙	어드밴스드 셀 진단 Inc.	300104
RNAscope 2.5 HD 검출 시약-BROWN	어드밴스드 셀 진단 Inc.	322310	이 키트에는 증폭 시약 AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 및 AMP6과 검출 시약 DAB-A 및 DAB-B가 포함되어
RNAscope 3-Plex 음성 대조군 프로브	어드밴스드 셀 진단 Inc.	320871	댁
RNAscope 3-Plex 포지티브 컨트롤 프로브	어드밴스드 셀 진단 Inc.	320861	증권
RNAscope 프로브- HPV16/18	어드밴스드 셀 진단 Inc.	311121
RNAscope 세척 완충액 시약	어드밴스드 셀 진단 Inc.	310091	세척 버퍼 50X x4

있습니다 시세 표시기