RNA CISH 신호 감지: 온전한 조직 표본에서 RNA 현장 혼성화 중 발색 신호를 감지하는 기술

초록

출처: Outh-Gauer, S. et al. HPV 관련 두경부암 진단을 위한 도구로서의 발색성 현장 혼성화. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 RNA 발색성 현장 혼성화 중 신호 검출을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 온전한 조직 표본에서 활동성 발암성 감염을 시각적으로 진단하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. counterstaining 시약의 준비

1. 50% 헤마톡실린을 준비합니다.
   1. 흄 후드에서 염색 접시에 있는 증류수 100mL에 Gill's hematoxylin I 100mL(재료 표 참조)를 추가합니다.
      메모: 50% 헤마톡실린 염색 용액은 최대 1주일 동안 재사용할 수 있습니다.
2. 0.02%(w/v) 암모니아수(블루잉 시약)를 준비합니다.
3. 흄 후드에서 눈금이 매겨진 실린더 또는 다른 용기에 있는 250mL의 증류수에 1N 수산화암모늄 1.43mL를 추가합니다. 파라핀 필름으로 실린더를 밀봉하십시오. 내용물을 3x–5x.
   위해 잘 섞습니다. 메모: 분석 정량 분석을 위해서는 수산화암모늄을 사용하는 것이 중요합니다. 시약은 미리 준비할 수 있습니다. 모든 용기가 덮여 있는지 확인하십시오.

2. 3,3'-디아미노벤지딘으로 신호 감지

주의: 디아미노벤지딘(DAB)은 독성이 있습니다. 이 화학 물질을 폐기하고 취급할 때 적절한 예방 조치와 안전 지침을 따르십시오.

1. 각 용액을 동일한 수의 방울을 분주하여 적절한 크기의 튜브에 동일한 부피의 DAB-A와 DAB-B(재료 표 참조)를 혼합합니다. 섹션당 ~120μL의 DAB 기질을 만듭니다(각 시약의 ~2방울/총 4개). 3x-5x용으로 잘 섞습니다.
2. 슬라이드 랙에서 각 슬라이드를 한 번에 하나씩 꺼내 슬라이드 랙에 넣기 전에 두드리거나 튕겨 여분의 액체를 제거합니다.
3. 각 조직 섹션에 ~120 μL의 DAB를 피펫으로 분사합니다. 섹션이 덮여 있는지 확인하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
4. 나머지 DAB는 현지 규정에 따라 폐기하고 슬라이드를 수돗물로 채워진 염색 접시에 담근 슬라이드 랙에 삽입합니다.

3. 카운터 스테인

1. 슬라이드 랙을 50% 헤마톡실린 염색 용액이 함유된 염색 접시로 옮기고 실온에서 30초 동안 그대로 둡니다. 슬라이드가 보라색으로 바뀝니다.
2. 즉시 슬라이드 랙을 수돗물이 담긴 염색 접시로 다시 옮기고 랙을 위아래로 움직여 슬라이드를 3x–5x 세척합니다.
3. 슬라이드가 깨끗해지고 섹션이 보라색으로 유지될 때까지 깨끗한 수돗물로 세척 단계를 계속 반복합니다.
4. 염색 접시의 수돗물을 0.02% 암모니아수로 교체하십시오. 랙을 위아래로 2–3배 이동합니다. 조직 부분이 파란색으로 바뀔 것입니다.
5. 암모니아 물을 수돗물로 교체하십시오. 슬라이드를 3x–5x 세척합니다.

4. 탈수

1. 슬라이드 랙을 흄 후드에 70% 에탄올이 함유된 염색 접시로 옮기고 가끔 저어주면서 2분 동안 그대로 두십시오.
2. 슬라이드 랙을 100% 에탄올이 함유된 첫 번째 염색 접시로 옮기고 가끔 저어주면서 2분 동안 그대로 둡니다.
3. 슬라이드 랙을 100% 에탄올이 함유된 두 번째 염색 접시로 옮기고 가끔 저어주면서 2분 동안 그대로 둡니다.
4. 슬라이드 랙을 자일렌이 함유된 염색 접시로 옮기고 가끔 저어주면서 5분 동안 그대로 두십시오.

5. 슬라이드 마운팅

1. 슬라이드 랙에서 슬라이드를 제거하고 섹션이 흄 후드에서 위를 향하도록 평평하게 놓습니다.
2. 각 슬라이드에 크실렌 기반 장착 매체 1방울을 추가하고 섹션 위에 24mm x 50mm 커버슬립을 조심스럽게 배치하여 한 번에 하나의 슬라이드를 장착합니다. 기포가 갇히지 않도록 하십시오.
3. 슬라이드를 ≥5분 동안 자연 건조합니다.

6. 샘플 평가

1. 표준 명시야 현미경으로 20x–40x 배율로 조직 단면을 검사합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
헤마톡실린 용액, Gill No. 1	머 크	GHS132
RNAscope 2.5 HD 검출 시약-BROWN	어드밴스드 셀 진단 Inc.	322310	이 키트에는 증폭 시약 AMP1, AMP2, AMP3, AMP4, AMP5 및 AMP6과 검출 시약 DAB-A 및 DAB-B가 포함되어
RNAscope 프로브- HPV16/18	어드밴스드 셀 진단 Inc.	311121
HybEZ 슬라이드 랙	어드밴스드 셀 진단 Inc.	300104
ImmEdge 소수성 배리어 펜	어드밴스드 셀 진단 Inc.	310018

있습니다